鄭國帥，趙　鑫，范國榮

[1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源學(xué)教研室，合肥 230031；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，上海市藥物(中藥)代謝產(chǎn)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433]

?

·論著·

黃酮醇糖苷及其結(jié)構(gòu)類似物的質(zhì)譜裂解規(guī)律研究

鄭國帥1,2，趙鑫2*，范國榮2

[1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源學(xué)教研室，合肥 230031；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，上海市藥物(中藥)代謝產(chǎn)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433]

[摘要]目的：研究創(chuàng)新藥物3′,4′-二甲氧基黃酮醇-D-葡萄糖苷(GDH)及其結(jié)構(gòu)類似物的質(zhì)譜裂解規(guī)律。方法：在正、負(fù)離子檢測(cè)模式下，對(duì)GDH及其結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行電噴霧離子阱質(zhì)譜(ESI-MSn)分析，并用Mass Frontier 6.0軟件輔助解析其中主要的特征碎片離子，以及可能的裂解途徑。結(jié)果：在正離子模式下，從3-羥基-3′,4′-二甲氧基黃酮醇(NDH21)獲得m/z 299、284、266、239、238、165、137等特征離子；從GDH獲得m/z 483、461、321、299等特征離子；從3-乙酰氧基-3′,4′-二甲氧基黃酮(NDH01)獲得m/z 363、321、306等特征離子；從3-丙酰氧基-3′,4′-二甲氧基黃酮(NDH02)獲得m/z 377、321、306等特征離子；從3，3′,4′-三甲氧基黃酮(甲基化NDH21)獲得m/z 335、320、305等特征離子。在負(fù)離子模式下，從NDH21、GDH、NDH01、NDH02和甲基化NDH21均獲得m/z 297、282、267等特征離子。結(jié)論：在正離子模式下，除了NDH21顯示較強(qiáng)的[M+H]+外，GDH及其他結(jié)構(gòu)類似物均顯示較強(qiáng)的[M+Na]+加合離子峰，主要產(chǎn)生丟失C環(huán)3-OH上取代基的碎片信息；除GDH外，其他黃酮醇糖苷類似物進(jìn)一步產(chǎn)生丟失B環(huán)甲基的裂解途徑。在負(fù)離子模式下，NDH21生成[M-H]-，GDH及其他結(jié)構(gòu)類似物主要通過丟失C環(huán)3-OH上取代基發(fā)生裂解，并且同樣出現(xiàn)丟失B環(huán)甲基的裂解途徑。

[關(guān)鍵詞]黃酮醇糖苷；電噴霧離子阱質(zhì)譜；裂解規(guī)律

[Pharm Care Res，2015，15(3): 196-200]

黃酮醇葡萄糖苷(flavonol glucose glycoside)是一類新合成的黃酮醇類降血脂藥物，可用于防治高血壓和腦溢血等疾病[1,2]。該類化合物是在3-羥基-3′,4′-二甲氧基黃酮醇(NDH21)的基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾得到[3](結(jié)構(gòu)圖見圖1)，已經(jīng)申請(qǐng)獲得國家專利[4]。雖然對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行質(zhì)譜分析的報(bào)道較多[5,6]，但對(duì)于新合成的黃酮醇結(jié)構(gòu)類似物GDH、3-乙酰氧基-3′,4′-二甲氧基黃酮(NDH01)、3-丙酰氧基-3′,4′-二甲氧基黃酮(NDH02)、3-羥基-3′,4′-二甲氧基黃酮醇(NDH21)及3，3′,4′-三甲氧基黃酮(甲基化NDH21)的質(zhì)譜解析和裂解規(guī)律，國內(nèi)外未見報(bào)道。電噴霧離子阱質(zhì)譜(electrospray ion trap tandem mass spectrometry,ESI-MSn)可以為黃酮醇類化合物提供準(zhǔn)分子離子峰及多級(jí)結(jié)構(gòu)信息，從而推測(cè)其裂解規(guī)律[7]。本研究采用ESI-MSn對(duì)5種黃酮醇結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行分析，并以Mass Frontier 6.0軟件綜合分析5個(gè)化合物的準(zhǔn)分子離子峰、特征碎片離子、質(zhì)譜特征與結(jié)構(gòu)信息，對(duì)質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行比較，為研究GDH在動(dòng)物體內(nèi)的代謝過程及進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾提供參考。

中文名稱R縮寫名稱3-羥基-3',4'-二甲氧基黃酮醇H-NDH213',4'-二甲氧基黃酮醇-D-葡萄糖苷Glu-GDH3-乙酰氧基-3',4'-二甲氧基黃酮CH3C(O)-NDH013-丙酰氧基-3',4'-二甲氧基黃酮CH3CH2C(O)-NDH023,3',4'-三甲氧基黃酮CH3-甲基化NDH21

圖1黃酮醇糖苷及其結(jié)構(gòu)類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

Figure 1Chemical structures of flavonol glucose

glycoside and its structural analogues

1材料和方法

1.1儀器LCQ Fleet 質(zhì)譜儀，包括ESI 離子源、

離子阱質(zhì)量分析器、XcaliburTM 2.0.7 SP1 數(shù)據(jù)處理軟件、Mass Frontier 6.0軟件(美國Thermo Fisher公司)；XS205DU 十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；S0200-230V-EU渦旋混合器(美國Labnet公司)。

1.2試劑和藥品GDH、NDH01、NDH02、NDH21、甲基化NDH21對(duì)照品(純度>99.0%，第二軍醫(yī)大學(xué)有機(jī)化學(xué)教研室提供)；甲醇(色譜純，德國Merck公司)。

1.3樣品溶液的配制精密稱取GDH對(duì)照品10 mg，置于10 ml 量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得GDH對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取GDH對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋至1.0 μg/ml，得GDH供試品溶液。同法配制1.0 μg/ml的NDH01、NDH02、NDH21和甲基化NDH21供試品溶液。

1.4質(zhì)譜條件離子源噴射電壓：4.5 kV，透鏡電壓：90 V，毛細(xì)管電壓：-1.0 V，毛細(xì)管溫度：350 ℃，鞘氣流速：12 L/min(40.0 arb)，輔助氣流速：2.4 L/min(8.0 arb)。

1.5ESI-MSn分析取上述1.0 μg/ml的GDH及其他黃酮醇結(jié)構(gòu)類似物供試品溶液，采用直接進(jìn)樣方式導(dǎo)入ESI離子源，先采用一級(jí)全掃描方式獲得待測(cè)物的準(zhǔn)分子離子峰，然后選擇準(zhǔn)分子離子峰和碎片離子峰進(jìn)行多級(jí)質(zhì)譜分析，獲得相應(yīng)的多級(jí)質(zhì)譜圖。

2結(jié)果和分析

2.1NDH21的ESI-MSn分析結(jié)果在正、負(fù)離子模式下 NDH21 的 ESI-MSn圖譜見圖 2。

圖2　NDH21的ESI-MSn譜圖Figure 2　The ESI-MSn spectra of NDH21A、B、C：正離子模式；D、E、F：負(fù)離子模式；A、D：一級(jí)質(zhì)譜圖；B、E：二級(jí)質(zhì)譜圖；C、F：三級(jí)質(zhì)譜圖；NDH21：3-羥基-3′,4′-二甲氧基黃酮醇

由圖 2 A可見，NDH21產(chǎn)生較強(qiáng)的準(zhǔn)分子離子峰m/z299[M+H]+，以及較弱的m/z321[M+Na]+。圖2B是對(duì)m/z299碎片離子的二級(jí)質(zhì)譜掃描結(jié)果，產(chǎn)生m/z284、266、239、165、137的碎片離子峰。圖2C是對(duì)m/z284碎片離子的三級(jí)掃描結(jié)果，產(chǎn)生m/z266和238的碎片峰。圖2D～F是負(fù)離子模式下NDH21的ESI-MSn圖譜。一級(jí)質(zhì)譜掃描得到NDH01的準(zhǔn)分子離子峰m/z297 [M-H]-，二級(jí)質(zhì)譜掃描得到m/z282碎片離子峰，對(duì)其進(jìn)行三級(jí)質(zhì)譜掃描，得到m/z267、254、239的碎片離子峰。正、負(fù)離子模式下NDH21的裂解途徑見圖3。

圖3　NDH21的質(zhì)譜裂解途徑Figure 3　The mass fragmentation pathway of NDH21NDH21：3-羥基-3′,4′-二甲氧基黃酮醇

2.2GDH的ESI-MSn分析結(jié)果正、負(fù)離子模式下GDH的ESI-MSn圖譜見圖4。由圖4可見，在正離子模式下一級(jí)質(zhì)譜掃描得到GDH準(zhǔn)分子離子峰m/z461[M+H]+，以及加合離子m/z483[M+Na]+；對(duì)m/z483進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得到碎片離子峰m/z321；對(duì)m/z461進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得到很強(qiáng)的m/z299碎片離子峰。負(fù)離子模式下，GDH產(chǎn)生很弱的準(zhǔn)分子離子峰m/z459[M-H]-，且出現(xiàn)較強(qiáng)的m/z297；對(duì)m/z297進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，可見其碎片離子峰m/z282；進(jìn)一步做三級(jí)質(zhì)譜掃描，得到m/z267碎片離子峰。

圖 4　GDH的ESI-MSn譜圖Figure 4　The ESI-MSn spectra of GDHA、B、C：正離子模式；D、E、F：負(fù)離子模式；A、D：一級(jí)質(zhì)譜圖；B、C、E：二級(jí)質(zhì)譜圖；F：三級(jí)質(zhì)譜圖；GDH：3′,4′-二甲氧基黃酮醇-D-葡萄糖苷

圖 5　GDH的質(zhì)譜裂解途徑Figure 5　The mass fragmentation pathway of GDHA:正離子模式下[M+Na]+與[M+H]+兩種離子的裂解途徑；B：負(fù)離子模式下[M-Glu]-離子的裂解途徑；GDH：3′,4′-二甲氧基黃酮醇-D-葡萄糖苷

正離子模式下的一級(jí)質(zhì)譜掃描顯示，GDH主要形成[M+Na]+和[M+H]+，分別對(duì)兩種加合離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，發(fā)現(xiàn)均丟失-Glu得到碎片離子峰m/z321和m/z299，進(jìn)一步對(duì)上述離子進(jìn)行三級(jí)掃描未發(fā)現(xiàn)有碎片生成。因此在正離子模式下，GDH的加合離子主要脫去1分子葡萄糖而生成二級(jí)碎片離子峰。負(fù)離子模式下的[M-H]-信號(hào)非常微弱，較強(qiáng)的m/z297與準(zhǔn)分子離子峰之間亦相差了1分子葡萄糖，因此推斷m/z297為GDH在負(fù)離子模式下斷裂糖苷鍵獲得。m/z297的二級(jí)質(zhì)譜掃描中出現(xiàn)較強(qiáng)的碎片離子峰m/z282，m/z282的三級(jí)質(zhì)譜掃描中出現(xiàn)較強(qiáng)的碎片離子峰m/z267、239，與NDH21相類似,因此推測(cè)GDH在負(fù)離子模式下與NDH21質(zhì)譜裂解途徑相同。正、負(fù)離子模式下GDH的裂解途徑見圖5。2.3NDH01的ESI-MSn分析結(jié)果正離子模式下NDH01的準(zhǔn)分子離子峰m/z 341[M+H]+信號(hào)較弱，而加合離子峰m/z 363[M+Na]+信號(hào)較強(qiáng)。m/z 363的二級(jí)質(zhì)譜顯示其C環(huán)上醇羥基形成的酯鍵斷裂并發(fā)生重排，生成m/z 321 [M+Na-CH2CO]+；三級(jí)質(zhì)譜掃描的m/z 306是B環(huán)上-OCH3脫去-CH3后得到。正離子模式下NDH01的裂解途徑見圖6A。在負(fù)離子模式下NDH01的ESI-MSn圖譜與GDH類似，提示負(fù)離子模式下兩者具有相同的裂解途徑。

2.4NDH02的ESI-MSn分析結(jié)果NDH02的準(zhǔn)分子離子峰m/z 355[M+H]+信號(hào)較弱，而加合離子m/z 377[M+Na]+信號(hào)較強(qiáng)，其二、三級(jí)質(zhì)譜信息與NDH01相同，裂解途徑見圖6B。負(fù)離子模式下NDH02的ESI-MSn圖譜與GDH類似，提示其與GDH具有相同的裂解途徑。

2.5甲基化NDH21的ESI-MSn分析結(jié)果正離子模式下甲基化NDH21產(chǎn)生較強(qiáng)的加合離子峰m/z 335[M+Na]+，以及較弱的準(zhǔn)分子離子峰m/z 313 [M+H]+。m/z 335的二級(jí)質(zhì)譜掃描獲得了裂解碎片離子峰m/z 320,進(jìn)一步裂解得到三級(jí)碎片離子峰m/z 305?？梢姸?jí)和三級(jí)質(zhì)譜掃描中的碎片離子峰是m/z 335先后丟失B環(huán)上-OCH3中的-CH3所致。正離子模式下甲基化NDH21的裂解途徑見圖6C。負(fù)離子模式下甲基化NDH21的ESI-MSn圖譜與GDH類似，提示其與GDH具有相同的裂解途徑。

3討論

圖6　NDH01、NDH02和甲基化NDH21在正離子模式下[M+Na]+的裂解途徑Figure 6　The fragmentation pathways of [M+Na]+ of NDH01，NDH02 and methylated NDH21 in positive modeA：NDH01；B：NDH02；C：甲基化NDH21;NDH01：3-乙酰氧基-3′,4′-二甲氧基黃酮；NDH02：3-丙酰氧基-3′,4′-二甲氧基黃酮；甲基化NDH21：3，3′,4′-三甲氧基黃酮

本研究采用ESI-MSn對(duì)創(chuàng)新藥物GDH及其結(jié)構(gòu)類似物NDH21、NDH01、NDH02、甲基化NDH21的質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行研究，根據(jù)ESI-MSn正、負(fù)離子模式下產(chǎn)生的多級(jí)碎片離子，推測(cè)并比較上述黃酮醇結(jié)構(gòu)類似物的裂解規(guī)律。在正離子模式下，NDH21的一級(jí)質(zhì)譜顯示出較強(qiáng)的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，而C環(huán)3-OH衍生化產(chǎn)物的一級(jí)質(zhì)譜均顯示出較強(qiáng)的[M+Na]+加合離子峰。NDH21結(jié)構(gòu)中C環(huán)上3位為羥基，是典型的黃酮醇結(jié)構(gòu)，其二級(jí)質(zhì)譜中未見RDA裂解(黃酮類化合物C環(huán)上的兩種裂解途徑之一)的碎片，可能是由于B環(huán)4′-OCH3產(chǎn)生的共軛作用，使得C環(huán)上2位碳電子云密度增加，不利于電荷分散[8]。相比之下，GDH的C環(huán)3-OH形成糖苷鍵，其二級(jí)質(zhì)譜主要呈現(xiàn)丟失1分子葡萄糖后的碎片離子，并且其三級(jí)質(zhì)譜掃描無明顯碎片離子。正離子模式下，C環(huán)上3-OH糖基化或?；幕衔锪呀馐紫葋G失的是該結(jié)構(gòu)上的糖基或者酰基，然后再丟失B環(huán)上的甲基；NDH01和NDH02二、三級(jí)質(zhì)譜中的碎片離子與NDH21一、二級(jí)質(zhì)譜中的碎片離子類似，而GDH則無三級(jí)質(zhì)譜碎片信息。由此可見，糖苷化產(chǎn)物GDH對(duì)黃酮母體結(jié)構(gòu)的保護(hù)最好，結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定；而C環(huán)上3位是甲氧基的甲基化NDH21則僅出現(xiàn)B環(huán)先后丟失甲基的裂解過程。在負(fù)離子模式下，GDH、NDH01、NDH02和甲基化NDH21的一級(jí)質(zhì)譜中均未發(fā)現(xiàn)明顯的準(zhǔn)分子離子峰， 出現(xiàn)的基峰是C環(huán)上3-OH取代基丟失后的碎片離子峰m/z297，其二、三級(jí)質(zhì)譜的碎片與NDH21一致，表明在負(fù)離子模式下，該類化合物具有相同的裂解規(guī)律。本研究對(duì)創(chuàng)新藥物GDH及其結(jié)構(gòu)類似物的質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行了初步分析，為進(jìn)一步研究該類化合物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化和基于NDH21的結(jié)構(gòu)修飾提供了重要信息。

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[修回日期]2015-05-28

[本文編輯]蘭芬

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Study on the mass fragmentation pathway of flavonol glucose glycoside and its structural analogues

ZHENG GuoShuai1,2,ZHAO Xin2*,FAN GuoRong2

[1.Department of Traditional Chinese Materia Medica Resources,School of Pharmacy，Anhui University of Chinese Medicine,Hefei 230031,China;2.Department of Pharmaceutical Analysis,School of Pharmacy,Second Military Medical University， Shanghai Key Laboratory for Pharmaceutical (Chinese Materia Medica) Metabolites Research，Shanghai 200433,China]

[ABSTRACT]Objective: To study the mass fragmentation pathway of 3′,4′-dimethoxy flavonol-D-glucose glycoside(GDH) and its structural analogues. Methods: GDH and its structural analogues were identified by electrospray ion trap tandem mass spectrometry(ESI-MSn) in positive and negative modes,respectively.The characteristic fragment ions and fragmentation pathways were explained with the aid of Mass Frontier 6.0 software. Results: In positive mode,ion peaks m/z 299，284，266，239，238，165，137 were detected for 3-hydroxy-3′,4′-dimethoxy flavonol(NDH21),m/z 483,461,321,299 for GDH,m/z 363，321，306 for 3-acetoxyl group-3′,4′-dimethoxy flavonoid(NDH01),m/z 377，321，306 for 3-propionyloxy-3′,4′-dimethoxy flavonoid(NDH02) and m/z 335，320，305 for 3, 3′,4′-trimethoxy flavonoid(methylated NDH21).In negative mode，ion peaks m/z 297,282,267 were all detected for GDH and its structural analogues． Conclusion: In positive mode,intensive ion fragment [M+Na]+ was detected in the mass spectra of GDH and its structural analogues,while NDH21 produced intensive molecular ion [M+H]+.The characteristic fragment ions were obtained through losing the substituent group of 3-OH on the C ring,and methyl group on the B ring of flavonoid was lost except GDH.In negative mode,molecular ion [M-H]- was detected for NDH21.GDH and its structural analogues were cracked through losing the substituent group of 3-OH on the C ring and methyl group on the B ring of flavonoid.

[KEY WORDS]flavonol glucose glycoside;electrospray ion trap tandem mass spectrometry;fragmentation pathway

[收稿日期]2015-03-20

DOI：10.5428/pcar20150312

[中圖分類號(hào)]R284

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-2838(2015)03-0196-05

作者簡(jiǎn)介鄭國帥(男)，碩士生.E-mail: zhengguo.shuai@163.com*通信作者(Corresponding author)：趙鑫，E-mail:yoyo0132@163.com