辜雪琴,齊　天，曲麗萍，范國(guó)榮*,亓云鵬,*

[1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 350122；2. 第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，上海市藥物(中藥)代謝產(chǎn)物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433]

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·論著·

用GC-MS法測(cè)定大鼠血漿中1,8-桉樹(shù)腦的濃度及其藥動(dòng)學(xué)研究

辜雪琴1,齊天2，曲麗萍2，范國(guó)榮2*,亓云鵬1,2*

[1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 350122；2. 第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，上海市藥物(中藥)代謝產(chǎn)物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433]

[摘要]目的：建立大鼠血漿樣品中1,8-桉樹(shù)腦的定量分析方法，并測(cè)定其在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。方法：以α-蒎烯為內(nèi)標(biāo)，采用GC-MS法，選擇離子模式(m/z 93)，建立大鼠血漿中1,8-桉樹(shù)腦的定量分析方法，并測(cè)定大鼠灌胃1,8-桉樹(shù)腦200 mg/kg后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果：1,8-桉樹(shù)腦與內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間分別為3.13和3.91 min；1,8-桉樹(shù)腦經(jīng)大鼠灌胃給藥后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)如下：t(max)為(0.75±0.16) h，c(max)為(26.55±3.73) μg/ml，t(1/2)為(1.92±0.60) h，MRT為(3.22±0.97) h，AUC(0～12 h)為(88.22±3.96) μg·h·ml(-1)，AUC(0～∞)為(91.24±4.13) μg·h·ml(-1)。結(jié)論：本方法靈敏度高、操作簡(jiǎn)單，可用于大鼠血漿中1,8-桉樹(shù)腦的含量測(cè)定及藥動(dòng)學(xué)研究。

[關(guān)鍵詞]1,8-桉樹(shù)腦；藥代動(dòng)力學(xué)；氣相色譜-質(zhì)譜法；α-蒎烯

[Pharm Care Res，2015，15(3): 189-192]

1,8-桉樹(shù)腦(1,8-cineole)，又名桉葉油素(eucalyptol)，具有樟腦和清涼的草藥氣味，廣泛存在于桉葉油等270多種天然精油中。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，1,8-桉樹(shù)腦具有明確的抗炎作用，可抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[1]，緩解硝基苯誘導(dǎo)的結(jié)腸炎[2]，對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠肝衰竭有保護(hù)作用[3]，對(duì)血管、腸平滑肌有松弛作用[4]等。目前，對(duì)于1,8-桉樹(shù)腦這一有效抗炎單體尚未開(kāi)展系統(tǒng)的藥動(dòng)學(xué)研究。考慮到1,8-桉樹(shù)腦具有揮發(fā)性，本研究擬采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)，建立大鼠血漿樣品中1,8-桉樹(shù)腦的定量分析方法，并將其用于1,8-桉樹(shù)腦在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究。

1儀器和試藥

1.1儀器GC-MS聯(lián)用儀(包括AS3000自動(dòng)進(jìn)樣器、氣相色譜儀、ITQ1100質(zhì)譜儀和Xcalibur2.0工作站)和CR3i臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)賽默飛世爾公司)；高純氦(99.999%，上海都茂愛(ài)凈化氣有限公司)；HA-202M電子天平(日本A&D公司)。

1.2藥品和試劑1,8-桉樹(shù)腦對(duì)照品(純度>99%)和α-蒎烯(純度>98%)均為大連美侖生物技術(shù)有限公司提供；乙酸乙酯(色譜純，美國(guó)Tedia公司)；肝素鈉(上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號(hào) 130301)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，雌雄各半，體重約180 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(滬)2012-0002。

2方法和結(jié)果

2.1色譜條件GL-5 MS毛細(xì)管氣相色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，固定液：5%苯基+95%二甲基聚硅氧烷)。程序升溫：起始溫度為70 ℃，15 ℃/min升至130 ℃，保持0.5 min，30 ℃/min升至280 ℃，保持2 min。進(jìn)樣量：1 μl，分流比：30∶1，柱流量：1 ml/min。進(jìn)樣口溫度：250 ℃，傳輸線溫度：250 ℃，離子源溫度：220 ℃， EI源：70 eV；溶劑延遲時(shí)間：2 min。采用選擇離子模式(SIM)：2～5 min采集m/z93(1,8-桉樹(shù)腦及內(nèi)標(biāo))，內(nèi)標(biāo)為α-蒎烯。

2.2溶液的配制

2.2.11,8-桉樹(shù)腦對(duì)照品溶液及其內(nèi)標(biāo)溶液的配制精密稱取1,8-桉樹(shù)腦對(duì)照品25.7 mg置25 ml量瓶中，加乙酸乙酯定容，得濃度為1.028 mg/ml的1,8-桉樹(shù)腦對(duì)照品儲(chǔ)備液，臨用時(shí)用乙酸乙酯稀釋成相應(yīng)的濃度。稱取內(nèi)標(biāo)α-蒎烯25.0 mg，用乙酸乙酯溶解，制得濃度為1.0 mg/ml的α-蒎烯對(duì)照品儲(chǔ)備液，用乙酸乙酯稀釋后制得濃度為10 μg/ml的α-蒎烯內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.2大鼠灌胃用溶液的配制精密稱取1,8-桉樹(shù)腦對(duì)照品500.0 mg，加入2%的吐溫80無(wú)菌注射用水25 ml，制得濃度為20.0 mg/ml的1,8-桉樹(shù)腦混懸液。

2.3給藥方案，血漿樣品采集及前處理SD大鼠6只，雌雄各半，禁食12 h過(guò)夜。按200 mg/kg灌胃1,8-桉樹(shù)腦對(duì)照品溶液，分別于給藥后10、20、30、45 min，1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12 h眼眶取血0.5 ml，置于1.5 ml涂有肝素鈉的EP管中，上下振搖3次，6×103×g離心10 min，取上清液，置-20 ℃冰箱中保存待用。取大鼠血漿樣品100 μl，置5 ml玻璃離心管中，加入10 μl濃度為10 μg/ml的α-蒎烯內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合1 min后，加入200 μl乙酸乙酯，渦旋3 min，1.5×103×g離心10 min。取180 μl上清液于進(jìn)樣瓶中，用GC-MS分析，內(nèi)標(biāo)法定量。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1方法特異性研究在上述研究條件下，1,8-桉樹(shù)腦和α-蒎烯與血漿中內(nèi)源性物質(zhì)分離完全，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾分離分析，兩藥保留時(shí)間分別為3.13和3.91 min，色譜圖見(jiàn)圖1。信噪比(S/N)>10時(shí)1,8-桉樹(shù)腦最低定量濃度為0.102 8 μg/ml，RSD值為9.70%。

2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限取空白血漿90 μl，精密加入1,8-桉樹(shù)腦對(duì)照品溶液10 μl，渦旋混勻，配成含1,8-桉樹(shù)腦濃度為0.102 8、0.205 6、0.514 0、1.028、2.056、5.14、10.28 μg/ml的含藥血漿，按照2.3項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以待測(cè)物濃度(X)為橫坐標(biāo)，待測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)為縱坐標(biāo)，求得1,8-桉樹(shù)腦回歸方程：Y=0.602 8X-0.024 0(r=0.998 7)。結(jié)果表明，1,8-桉樹(shù)腦在0.102 8～10.28 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性良好。

圖1　大鼠血漿中1,8-桉樹(shù)腦和內(nèi)標(biāo)α-蒎烯的GC-MS譜圖Figure 1　GC-MS photograms of 1,8-cineole and the internal standard α-pinene in the plasma of ratsA：空白血漿；B：空白血漿+1,8-桉樹(shù)腦+內(nèi)標(biāo)α-蒎烯；C：給藥后大鼠血漿樣品；1:1,8-桉樹(shù)腦；2:α-蒎烯

2.4.3精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)制備1,8-桉樹(shù)腦濃度分別為0.205 6、1.028、8.224 μg/ml的低、中、高濃度對(duì)照品血漿，每個(gè)濃度5份，按2.3項(xiàng)下方法處理后，于1 d內(nèi)5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定，連續(xù)3 d。將待測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值代入當(dāng)天的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實(shí)測(cè)濃度，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度與準(zhǔn)確度。結(jié)果日內(nèi)、日間RSD均<15% (見(jiàn)表1)。準(zhǔn)確度以方法回收率表示，同法制備低、中、高濃度對(duì)照品血漿樣品各5份，按照2.3項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，計(jì)算待測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算實(shí)測(cè)濃度與加入濃度的比值即為方法回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.4提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)同法制備低、中、高濃度對(duì)照品血漿樣品各5份，按2.3項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，得峰面積作為Set 1。用乙酸乙酯提取空白血漿，基質(zhì)殘?jiān)孟鄳?yīng)濃度對(duì)照品溶液復(fù)溶，使之濃度與Set 1待測(cè)理論濃度一致，每個(gè)濃度平行操作5份，離心后取上清液進(jìn)行分析得峰面積作為Set 2。將對(duì)照品溶液用乙酸乙酯稀釋，使之與Set 1待測(cè)理論濃度一致，每個(gè)濃度平行制備3份，進(jìn)樣分析得峰面積作為Set 3。通過(guò)Set 1與Set 3中1,8-桉樹(shù)腦峰面積均值的比值求得1,8-桉樹(shù)腦的提取回收率，以Set 2與Set 3中1,8-桉樹(shù)腦峰面積均值的比值來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，血漿樣品中1,8-桉樹(shù)腦的提取回收率>90%，且生物基質(zhì)基本穩(wěn)定，通過(guò)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線校正，生物基質(zhì)不影響樣品的測(cè)定(見(jiàn)表2)。

表2提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Table 2Results of extraction recovery

and matrix effect tests

濃度(ρB/μg·ml-1)提取回收率基質(zhì)效應(yīng)0.205693.69±2.79107.19±2.391.02899.03±3.71101.78±1.438.22491.29±2.71103.59±2.03

2.4.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)同法制備低、中、高濃度對(duì)照品血漿樣品，考察室溫(25 ℃)放置3 h、凍融循環(huán)3次后提取、提取后在自動(dòng)進(jìn)樣器上放置24 h的穩(wěn)定性。以測(cè)得的1,8-桉樹(shù)腦與內(nèi)標(biāo)峰面積比值與其平均初始比值比較，以兩者的相對(duì)誤差來(lái)評(píng)價(jià)穩(wěn)定性。結(jié)果表明，血漿樣品處理后在上述條件下均穩(wěn)定，RSD均<9%(n=3)。

2.5血樣測(cè)定按2.3項(xiàng)下方法采集血樣，測(cè)定6只SD大鼠灌胃給藥后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度，并繪制平均血藥濃度-時(shí)間曲線，見(jiàn)圖2。藥動(dòng)學(xué)參數(shù)采用BAPP 3.1軟件以非房室模型進(jìn)行分析， 得到藥動(dòng)學(xué)參數(shù)如下：tmax為(0.75±0.16) h，cmax為(26.55±3.73) μg/ml，t1/2為(1.92±0.60) h，MRT為(3.22±0.97) h，AUC0～12 h為(88.22±3.96) μg·h·ml-1，AUC0～∞為(91.24±4.13) μg·h·ml-1。

圖2　1,8-桉樹(shù)腦的平均血藥濃度-時(shí)間曲線Figure 2　The mean drug concentration-time curve of 1,8-cineole

3討論

文獻(xiàn)報(bào)道50～400 mg/kg為1,8-桉樹(shù)腦發(fā)揮抗炎作用的有效口服劑量[5]，因此本研究的給藥劑量確定為200 mg/kg?？紤]到α-蒎烯與1,8-桉樹(shù)腦結(jié)構(gòu)類似，故本研究選用α-蒎烯為內(nèi)標(biāo)，兩者保留時(shí)間相差不大，縮短了分析時(shí)間。

在優(yōu)化GC-MS分析條件時(shí)，采用選擇離子模式(SIM)進(jìn)行定量，根據(jù)定量離子應(yīng)選擇質(zhì)荷比相對(duì)較大、離子豐度相對(duì)較高的原則，1,8-桉樹(shù)腦的基峰為m/z43，不適合選為定量離子，而m/z93是 1,8-桉樹(shù)腦豐度較高的離子，也是內(nèi)標(biāo)α-蒎烯的基峰。因此采用SIM(m/z93)進(jìn)行定量分析，1,8-桉樹(shù)腦及內(nèi)標(biāo)峰兩者分離完全，峰形良好，提高了分析方法的準(zhǔn)確性及靈敏度。與目前文獻(xiàn)報(bào)道方法比較[6]，本研究建立的GC-MS方法，樣品前處理采用乙酸乙酯進(jìn)行提取，方法簡(jiǎn)單；GC-MS分析樣品的時(shí)間短，總運(yùn)行時(shí)間為11.5 min；且通過(guò)SIM進(jìn)行檢測(cè)分析，方法的專屬性好。

本研究建立了GC-MS法測(cè)定1,8-桉樹(shù)腦在SD大鼠體內(nèi)的血藥濃度，專屬性好，血漿內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)1,8-桉樹(shù)腦及內(nèi)標(biāo)α-蒎烯的測(cè)定無(wú)干擾，血漿樣品中1,8-桉樹(shù)腦的線性、準(zhǔn)確度、精密度及穩(wěn)定性均符合生物樣品的分析要求。將該方法運(yùn)用于1,8-桉樹(shù)腦大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究，結(jié)果表明，1,8-桉樹(shù)腦口服吸收較快，且在大鼠體內(nèi)消除較快。相關(guān)文獻(xiàn)表明，1,8-桉樹(shù)腦具有很強(qiáng)的滲透性[7]，可開(kāi)發(fā)為透皮吸收給藥制劑，作為局部抗炎、抗菌藥物使用。本研究為含有1,8-桉樹(shù)腦的揮發(fā)油的藥動(dòng)學(xué)研究、新藥研究的代謝篩選和臨床用藥的療效評(píng)價(jià)提供了重要依據(jù)。

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[修回日期]2015-05-07

[本文編輯]陽(yáng)凌燕

Concentration determination of 1,8-cineole in rat plasma by GC-MS method and its pharmacokinetics study

GU XueQin1,QI Tian2,QU LiPing2,FAN GuoRong2*,QI YunPeng1,2*

[1.School of Pharmacy,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350122,China；2.Department of Pharmaceutical Analysis,School of Pharmacy,Second Military Medical University,Shanghai Key Laboratory for Pharmaceutical (Chinese Materia Medica) Metabolites Research,Shanghai 200433,China]

[ABSTRACT]Objective: To establish the quantitative analysis method of 1,8-cineole in rat plasma and determine its pharmacokinetic parameters in vivo. Methods: Quantitative analysis method for 1,8-cineole in rat plasma was established by using GC-MS, with selected ion mode (m/z 93) and α-pinene as internal standard. Pharmacokinetic parameters of 1,8-cineole were studied after gavage 200 mg/kg to the rats. Results: Retention time for 1,8-cineole and internal standard α-pinene were 3.13 and 3.91 min, respectively. The main pharmacokinetic parameters of 1,8-cineole after gavage were as follows: t(max) (0.75±0.16) h,c(max) (26.55±3.73) μg/ml,t(1/2) (1.92±0.60) h,MRT (3.22±0.97) h,AUC(0-12 h) (88.22±3.96) μg·h·ml(-1) and AUC(0-∞) (91.24±4.13) μg·h·ml(-1).Conclusion: The proposed method is sensitive and simple,and could be used for the determination and pharmacokinetics study of 1,8-cineole.

[KEY WORDS]1,8-cineole;pharmacokinetics;gas chromatography-mass spectrometry;α-pinene

[收稿日期]2014-12-09

DOI：10.5428/pcar20150310

[中圖分類號(hào)]R927.2，R969.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-2838(2015)03-0189-04

作者簡(jiǎn)介辜雪琴(女)，碩士生.E-mail: guxueqin0906@163.com*通信作者(Corresponding author)：亓云鵬，E-mail：qiyunpeng@hotmail.com；范國(guó)榮，E-mail：guorfan@outlook.com

基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金(81173019)，第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院“時(shí)珍學(xué)者培養(yǎng)計(jì)劃”資助項(xiàng)目