王志茹，李　軍，劉曉梅，吳紅聯(lián)，朱德生

(1. 吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，長(zhǎng)春　130021；2. 北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京　100871)

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雄性生殖細(xì)胞特異性表達(dá)綠色熒光蛋白小鼠的繁殖及其表型鑒定

王志茹1,2，李軍2，劉曉梅1，吳紅聯(lián)2，朱德生2

(1. 吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，長(zhǎng)春130021；2. 北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京100871)

【摘要】目的繁殖雄性生殖細(xì)胞特異性表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)小鼠，為進(jìn)行小鼠生殖系統(tǒng)毒性研究提供有效的工具。 方法 將Ddx4-cre轉(zhuǎn)基因雄鼠與Rosa26mT/mG轉(zhuǎn)基因雌鼠交配，產(chǎn)生子代動(dòng)物，利用分子生物學(xué)、組織病理學(xué)及活體成像等技術(shù)，分別從分子、細(xì)胞和組織水平對(duì)子代及其親代小鼠進(jìn)行表型鑒定。 結(jié)果 PCR結(jié)果表明在子代小鼠的睪丸組織中發(fā)生了Cre酶介導(dǎo)的特異性基因重組；活體成像可以看到在F1代小鼠的睪丸組織中具有GFP的表達(dá)；睪丸冰凍切片及精子熒光觀(guān)察顯示GFP主要表達(dá)于次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子中。 結(jié)論 雄性生殖細(xì)胞特異性表達(dá)GFP小鼠繁殖成功。

【關(guān)鍵詞】睪丸；特異性；基因重組；綠色熒光蛋白

生殖系統(tǒng)的改變是造成不孕不育的重要原因，如何簡(jiǎn)易快速的檢測(cè)生殖系統(tǒng)的損傷是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。在絕大多數(shù)物種中，Ddx4基因特異性表達(dá)于生殖細(xì)胞中[1]，常被用作分子標(biāo)記研究配子發(fā)生和原始生殖細(xì)胞的起源、遷移、分化等方面。雄性生殖細(xì)胞的 DDX4 蛋白表達(dá)，從12.5dpc生殖嵴一直持續(xù)到減數(shù)分裂后的精子細(xì)胞[2]。本研究利用生殖系統(tǒng)特異性啟動(dòng)子Ddx4啟動(dòng)的Cre酶，通過(guò)Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)[3]產(chǎn)生雄性生殖細(xì)胞特異性表達(dá)GFP小鼠模型，為后續(xù)進(jìn)行雄性小鼠生殖系統(tǒng)發(fā)育和毒性研究提供理想的動(dòng)物模型。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)B6.FVB-Tg(Ddx4-cre)1Dcas/JnjuDdx4-cre小鼠(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為Ddx4-cre小鼠)4只，雌雄各半，雄性為雜合子(T/W)，雌性為純合子(T/T)；SPF級(jí)B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-GFP)Luo小鼠(以下簡(jiǎn)稱(chēng)Rosa26mT/mG小鼠)4只，雌雄各半，均為純合子(mut/mut)。小鼠周齡4～8周，均購(gòu)自南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院 【SCXK(蘇)2010-0001】。飼養(yǎng)于北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(京)2011-0003】，飼養(yǎng)條件符合SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。

Ddx4-cre小鼠在Ddx4啟動(dòng)子調(diào)控下在生殖系統(tǒng)中特異性表達(dá)Cre酶的轉(zhuǎn)基因小鼠[4]。Rosa26mT/mG小鼠是全身組織器官表達(dá)紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠，當(dāng)其與Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配產(chǎn)生的后代將發(fā)生Cre酶介導(dǎo)的特異性基因重組，將敲除mT基因，從而激活mG基因的表達(dá)，產(chǎn)生綠色熒光蛋白(彩插10圖1)[5]。

1.2動(dòng)物交配

Ddx4-cre小鼠4只，雌雄各半，雄性為雜合子，雌性為純合子，1∶1交配，擴(kuò)大種群。

Rosa26小鼠4只，雌雄各半，均為純合子，1∶1交配，擴(kuò)大種群。

圖2　Ddx4-cre♂小鼠與Rosa26mT/mG♀小鼠交配可能產(chǎn)生的子代的基因型和表型Fig.2　Genotype and phenotype of offspring by mating the Ddx4-cre male mice with the Rosa26mT/mG female mice

Ddx4-cre小鼠6只，雄性，雜合子(T/W)；與Rosa26小鼠6只，雌性，純合子(mut/mut)；1∶1交配，獲得 F1代雄性小鼠，其基因型可分為兩種 Ddx4-cre(T/W)；Rosa26mT/mG(mut /wt)與Ddx4-cre(W/W)； Rosa26mT/mG(mut/wt)。而在表達(dá)Cre酶的組織，會(huì)產(chǎn)生Cre酶誘導(dǎo)的基因重組，切除mT基因。通過(guò)交配產(chǎn)生子代可能的基因型和表型(圖2)。1.3雙陽(yáng)性F1代雄性小鼠的篩查利用PCR的方法，對(duì)母代和子代雄性小鼠進(jìn)行基因型鑒定。提取鼠尾DNA，PCR擴(kuò)增檢測(cè)Ddx4-cre基因和Rosa26mT/mG基因，確定小鼠基因型，篩選基因型為Ddx4-cre(T/W)；Rosa26mT/mG(mut /wt)的子代小鼠，為雙陽(yáng)性F1代雄性小鼠。Ddx4-cre基因擴(kuò)增條件為94℃ 30 s，62℃ 35 s，72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；Rosa26mT/mG基因擴(kuò)增條件為94℃ 30 s，61℃ 1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)。所使用的引物及其意義(表1)。

表1　PCR引物、擴(kuò)增片段及目的

1.4動(dòng)物分組

為了研究通過(guò)交配產(chǎn)生的動(dòng)物的基因型和表型，我們選取三組動(dòng)物。Ddx4-cre小鼠4只，雄性，周齡4～5周，為陰性對(duì)照鼠；Rosa26mT/mG小鼠4只，雄性，周齡4～5周，為紅色熒光蛋白對(duì)照鼠；雙陽(yáng)性F1代小鼠4只，雄性，周齡4～5周為實(shí)驗(yàn)鼠。

1.5DNA提取

利用濃鹽法提取組織DNA[6]，加入500 μL(含5 μL蛋白酶K)的組織裂解液放到52℃恒溫水浴箱中消化過(guò)液，加入5 mol/L NaCl 250 μL，混勻，冰浴10 min。12000 r/min，離心10 min，吸上清400 μL加入1 mL預(yù)冷的無(wú)水乙醇，12000 r/min 離心10 min后去上清，干燥沉淀后加入60 μL去離子水55℃溶解DNA。

1.6PCR擴(kuò)增體系

PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括：10×Buffer 2 μL，2.5 mmol/LdNTP 1.6 μL，10μm引物各0.4 μL，5U rTaq酶0.4 μL，模板DNA 1 μL，去離子水14.2 μL。PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.7組織mT基因擴(kuò)增

利用3組動(dòng)物的睪丸組織(去除被膜組織)及實(shí)驗(yàn)鼠的腦、心、肝、脾、肺、腎、腸，提取DNA，PCR擴(kuò)增檢測(cè)mT基因。引物與目的片段(表1)。擴(kuò)增條件為94℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)。

1.8組織熒光觀(guān)察

頸椎脫臼法處死小鼠，取出腦、心、肝、脾、肺、腎、腸、睪丸，利用小動(dòng)物成像儀進(jìn)行離體組織的熒光觀(guān)察，紅色熒光(激發(fā)光536/40 nm；發(fā)射光590/20 nm)；綠色熒光(激發(fā)光425/26 nm；發(fā)射光520/35 nm)，曝光時(shí)間均為1 s。

1.9組織冰凍切片的熒光觀(guān)察

將固定于4%甲醛溶液中的組織，轉(zhuǎn)入6～10 mL 30%蔗糖溶液中沉糖過(guò)夜，用OCT膠包埋，儲(chǔ)存于-20℃冰箱中，備用。利用冰凍切片機(jī)進(jìn)行組織切片(10 μm)，無(wú)水乙醇固定，DAPI染色，封片，觀(guān)察。

1.10精子熒光觀(guān)察

分離附睪置于1 mL生理鹽水，將附睪橫切為若干段，用眼科鑷子輕輕擠壓附睪組織塊，去掉附睪。靜止5 min，熒光顯微鏡觀(guān)察精子熒光。

2結(jié)果

2.1雙陽(yáng)性F1代雄性小鼠的篩查

通過(guò)F1代雄鼠鼠尾DNA PCR檢測(cè)，結(jié)果(圖3、圖4)證明1-4號(hào)F1代雄性小鼠攜帶了父代的Ddx4-cre基因和母代的Rosa26mT/mG基因。

注：M：Maker DL2000；“wt”：野生型。圖3　圖3　Ddx4-cre基因PCR電泳圖Note：M represents Maker DL2000；“wt” represents wild type.Fig.3　PCR electrophoresis of Ddx4-cre

注：M：Maker DL2000；“wt”：野生型。圖4　Rosa26mT/mG基因PCR電泳圖Note：M represents Maker DL2000；“wt” represents wild type.Fig.4　PCR electrophoresis of Rosa26mT/mG

2.2組織mT基因的擴(kuò)增

雙陽(yáng)性F1小鼠mT基因的擴(kuò)增結(jié)果顯示只有睪丸組織DNA不能擴(kuò)增出mT基因(圖5)。雙陽(yáng)性F1代小鼠睪丸組織mT基因的擴(kuò)增結(jié)果和其親代鼠的睪丸組織DNA 的PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖6，F(xiàn)1代小鼠睪丸組織未能擴(kuò)增出mT基因，而其親代的Rosa26mT/mG鼠睪丸組織DNA可以擴(kuò)增出mT基因。這表明雙陽(yáng)性F1小鼠睪丸組織在基因水平上確實(shí)發(fā)生了Cre酶介導(dǎo)的基因重組。

2.3整體器官熒光觀(guān)察

小鼠的離體器官的小動(dòng)物成像觀(guān)察，雙陽(yáng)性F1代鼠的腦、心、肝、脾、肺、腎、腸、睪丸組織呈現(xiàn)紅色熒光，但睪丸組織可觀(guān)察到綠色熒光而其他組織無(wú)綠色熒光(彩插10圖7)。

注：1：腦；2：心；3：睪丸；4：肝；5：脾；6：肺；7：腎；8：腸；M：Maker DL2000。圖5　F1 子鼠不同組織mT基因PCR電泳圖Note：1：brain；2：heart；3：testis；4： liver；5：spleen；6：lung；7：kidny；8：gut；M：Maker DL2000.Fig.5　PCR results of mT gene in different tissue in F1 offspring

注：1：F1睪丸組織DNA；2：Rosa26mT/mG鼠睪丸組織DNA；3：Ddx4-cre鼠睪丸組織DNA。圖6　親代和子代動(dòng)物睪丸組織mT基因PCR電泳圖Note：1： the testis DNA of the F1 mouse;2： the testis DNA of the Rosa26mT/mG mouse;3： the testis DNA of the Ddx4-cre mouse.Fig.6　PCR results of testicular tissue mT gene in F1 offspring and its parents

2.4組織學(xué)熒光觀(guān)察

雙陽(yáng)性F1代小鼠和親代小鼠腦、心、肝、脾、肺、腎、腸、睪丸組織冰凍切片結(jié)果觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)只有在子代F1睪丸組織細(xì)胞中具有GFP的表達(dá)(彩插11圖8)，GFP主要表達(dá)于生精小管細(xì)胞中，且集中于次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子中。

2.5精子熒光觀(guān)察

倒置熒光顯微鏡觀(guān)察雙陽(yáng)性F1代小鼠精子和Rosa26mT/mG鼠精子，結(jié)果表明：F1代子鼠精子具有GFP的表達(dá)，而其親代的Rosa26mT/mG小鼠的精子呈微弱的紅色熒光(彩插11圖9)。

3討論

熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)極大地促進(jìn)了生物學(xué)醫(yī)藥科學(xué)的研究。目前研究較廣泛的熒光蛋白為紅色熒光蛋白(RFP)和GFP，其中GFP享有現(xiàn)代生物學(xué)北斗星的美譽(yù)，其具有熒光穩(wěn)定、易于檢測(cè)、表達(dá)調(diào)控簡(jiǎn)單、生物安全性好等優(yōu)點(diǎn)[7]。本研究利用Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)制作雄性生殖細(xì)胞特異性表達(dá)GFP小鼠模型，這為我們后續(xù)研究雄性小鼠生殖系統(tǒng)功能與毒性等領(lǐng)域提供理想的動(dòng)物模型。

本實(shí)驗(yàn)將Ddx4-cre雄鼠與Rosa26mT/mG雌鼠交配篩選體內(nèi)同時(shí)具有Cre基因與Rosa26mT/mG基因的雙陽(yáng)性F1代雄性小鼠，對(duì)其進(jìn)行基因型和表型鑒定。mT基因的擴(kuò)增結(jié)果表明，僅在睪丸組織產(chǎn)生了mT基因的切除。而離體器官的熒光觀(guān)察結(jié)果表明F1代子鼠的睪丸組織具有GFP的表達(dá)，組織學(xué)熒光觀(guān)察結(jié)果證明GFP主要表達(dá)于生精小管細(xì)胞中，且集中表達(dá)于次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子中。而大量的文獻(xiàn)研究表明DDX4蛋白在小鼠精原細(xì)胞與初級(jí)精母細(xì)胞均有表達(dá)[8]，即精原細(xì)胞與初級(jí)精母細(xì)胞應(yīng)均具有Cre酶的表達(dá)而發(fā)生特異的基因重組，但在精原細(xì)胞與初級(jí)精母細(xì)胞卻未觀(guān)察到綠色熒光，這可能是因?yàn)榇渭?jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子中綠色熒光強(qiáng)度太強(qiáng)，在同等條件下掩蓋了精原細(xì)胞與初級(jí)精母細(xì)胞的綠色熒光。

參考文獻(xiàn)：

[1]Kakiuchi K, Tsuda A, Goto Y,etal. Cell-Surface DEAD-Box Polypeptide 4-Immunoreactive Cells and Gonocytes Are Two Distinct Populations in Postnatal Porcine Testes[J]. Biol Reprod. 2014;90.

[2]Fujiwara Y, Komiya T, Kawabata H,etal. Isolation of a Dead-Family Protein Gene That Encodes a Murine Homolog of Drosophila-Vasa and Its Specific Expression in Germ-Cell Lineage[J]. P Natl Acad Sci USA. 1994;91:12258-62.

[3]Kage-Nakadai E, Imae R, Suehiro Y,etal. A Conditional Knockout Tool kit for Caenorhabditis elegans Based on the Cre/loxP Recombination[J]. Plos One. 2014;9.

[4]Gallardo T, Shirley L, John GB,etal. Generation of a germ cell-specific mouse transgenic Cre line, Vasa-Cre[J]. Genesis. 2007;45:413-7.

[5]Muzumdar MD, Tasic B, Miyamichi K,etalA global double-fluorescent cre reporter mouse[J]. Genesis. 2007;45:593-605.

[6]Poh JJ, Gan SKE. Comparison of customized spin-column and salt-precipitation finger-prick blood DNA extraction[J]. Bioscience Rep. 2014;34:629-34.

[7]張雨麗，張桂征，蘇紅梅，等. 綠色熒光蛋白在轉(zhuǎn)基因研究中的應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通報(bào),2010(9):16-19.

[8]Toyooka Y, Tsunekawa N, Akasu R,etal. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro[J]. P Natl Acad Sci USA. 2003;100:11457-62.

〔修回日期〕2015-03-31

研究報(bào)告

Production and phenotype identification of specific expressed

green fluorescent protein in male mice germ cells

WANG Zhi-ru1,2，LI Jun2，LIU Xiao-mei1，WU Hong-lian2，ZHU De-sheng2

(1. School of public health，Jilin University，Changchun 130021，China；2.Peking University Laboratory animal centre，Beijing 100871，China)

【Abstract】ObjectiveThe aim of this study is production of organ specific animal model for studying reproductive toxicity in mice. Methods F1 generation was gotten by mating the Ddx4-cre transgenic male mice with the Rosa26mT/mG transgenic female mice. F1 offspring and its parents phenotype was screened by molecular biological, histopathological and in vivo imaging technology. ResultsAt molecular level, specific DNA fragment was only found in testis of F1 offspring; At the organ level, the expression of green fluorescent protein could only be observed in testis of F1 offspring; Testicular frozen sections and sperm fluorescence observation showed that green fluorescent protein were mainly expressed in the germ cell lineage such as secondary spermatocyte and spermatocyte and spermatozoon. ConclusionsThe production of the mice with specific germ cell expressed green fluorescent protein by Cre/loxP recombination system were built successfully.

【Key words】Testis；Specificity；Gene recombination；Green fluorescent protein

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.007

【中圖分類(lèi)號(hào)】R332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2015) 05-0029-04

[通訊作者]朱德生(1960-)， 男，高級(jí)工程師，研究方向：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，Email：deshengz@pku.edu.cn。

[作者簡(jiǎn)介]王志茹(1988-)，女，碩士生，研究方向：納米毒理學(xué)，Email：843872569@qq.com。