王子皓，胡永艷，王文潔，董　偉，姜曉亮，劉　星，楊志偉

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京　100021)

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多巴胺D5受體通過抑制氧化應激對擴張型心肌病的調(diào)節(jié)作用

王子皓，胡永艷，王文潔，董偉，姜曉亮，劉星，楊志偉

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京100021)

【摘要】目的探討多巴胺D5受體是否會通過抑制氧化應激來影響擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy)的發(fā)生發(fā)展。 方法 建立心臟特異表達人多巴胺D5受體突變基因F173L(α-MHC-hD5F173L)和正?；?α-MHC-hD5WT)轉基因小鼠。用3月齡小鼠，首先檢測比較轉基因小鼠心臟內(nèi)ROS的產(chǎn)量和NOX2的表達量。然后對α-MHC-hD5F173L小鼠通過皮下給NADPH氧化酶的抑制劑羅布麻寧(Apocynin)4周，同時給PBS作為對照組，然后檢測各項心肌病相關指標。同時構建人多巴胺D5受體突變基因(hD5F173L)和正常多巴胺D5受體基因(hD5WT)的大鼠心肌細胞(H9C2)，檢測兩者在基礎條件下ROS產(chǎn)量的變化。 結果 α-MHC-hD5F173L轉基因小鼠的NADPH氧化酶的活性和NOX2蛋白的表達量均明顯高于野生型α-MHC-hD5WT 小鼠，羅布麻寧能顯著改善α-MHC-hD5F173L轉基因小鼠的心臟功能。H9C2-hD5F173L大鼠細胞系NOX2的表達量及ROS產(chǎn)量高于H9C2- hD5WT對照細胞。 結論 多巴胺D5受體可能通過抑制氧化應激而防止擴張型心肌病的發(fā)生發(fā)展。

【關鍵詞】擴張型心肌??；多巴胺D5受體；活性氧

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一種以心腔擴大、心肌收縮功能障礙為主要特征的心肌疾病[1-2]。其發(fā)病的原因復雜，包括特發(fā)性、家族或遺傳性、病毒感染和(或)免疫性、酒精性或中毒性等，但最終的臨床表現(xiàn)相似，如出現(xiàn)神經(jīng)激素的激活及心力衰竭等[3]。研究證明，許多不同的信號傳導通路都和擴張型心肌病有關系[4-7]，而其中的一些信號通路又和活性氧(ROS)的產(chǎn)生有著密切的聯(lián)系。同時越來越多的研究表明，氧化應激在擴張型心肌病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[4-9]。

NADPH氧化酶是心血管系統(tǒng)ROS的主要來源[10]。NADPH氧化酶由6部分組成：細胞膜多肽p22phox、gp91phox，細胞漿多肽P40phox、p47phox和p67phox，小分子G蛋白rac1或rac2。多個亞型的Nox (NAD(P)H oxidase)被發(fā)現(xiàn)，包括Nox 1, Nox 2, Nox 3, Nox 4, Nox 5，其分子量類似gp91phox，為65×103[11]。NOX4主要在血管平滑肌和腎臟細胞內(nèi)表達[12]，NOX2主要在心臟內(nèi)表達[13]。

多巴胺受體是一種G蛋白偶聯(lián)受體，包括D1類和D2類受體。D1類受體包括D1受體和D5受體，該類受體增強腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclase，AC)活性，增加第二信使cAMP的產(chǎn)生。D2類受體包括D2、D3和D4，該類受體抑制AC活性[14]。前期的研究發(fā)現(xiàn)，D5受體基因敲除(D5-/-)小鼠血壓明顯升高，心臟重量增加、心肌肥厚[15-17]。全身表達hD5F173L (CMV-hD5F173L) 基因的轉基因小鼠與CMV-hD5WT對照小鼠相比， CMV-hD5F173L小鼠腎臟的NADPH氧化酶的活性和ROS的產(chǎn)生量顯著高于野生對照組，同時，3月齡開始血壓升高，4月齡開始左心室肥厚[18]。因此，我們建立了心臟特異表達人多巴胺hD5F173L基因小鼠，發(fā)現(xiàn)該轉基因小鼠出現(xiàn)典型擴張型心肌病的表型[19]。因此，在此基礎上，我們對多巴胺D5受體通過氧化應激在心臟肥大發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制進行研究。

1材料和方法

1.1實驗動物

SPF級C57BL/6J小鼠雌雄各15只，體重16～25 g，SPF級雄性ICR小鼠10只，雌性ICR小鼠20只，體重18～26 g，均購自北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2014-0004】；飼養(yǎng)在中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所【SYXK(京)2014-0029】，實驗中涉及動物的操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準【ILAS-PG-2014-005】。

1.2轉基因小鼠構建及動物試驗

將hD5FL173L或hD5WT基因插入心臟特異表達的α-MHC啟動子下游，構建α-MHC-hD5FL173L或α-MHC-hD5WT轉基因表達載體。用顯微注射法將線性化的轉基因表達載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，轉入受體假孕ICR小鼠中，小鼠出生14 d提取基因組 DNA，用PCR鑒定α-MHC-hD5FL173L或α-MHC-hD5WT轉基因小鼠的基因型。

為了驗證NADPH氧化酶在轉基因小鼠心肌擴張中的作用，我們用3月齡小鼠，通過皮下持續(xù)給ANDPH氧化酶的抑制劑Apocynin(SIGMA)，同時給PBS作為對照組。連續(xù)皮下注射給藥4周后(1 mmol/kg/day)，對小鼠超聲檢查，最后處死小鼠，取心臟稱重，并取同部分心肌組織用于ADPH氧化酶的活性和蛋白表達的測定。

1.3細胞培養(yǎng)和D5受體基因轉染

將人D5受體正?；騢D5WT或突變基因hD5F173L 的全cDNA在EcoRI和Xbal之間插入到pcDNA6/V5-His質(zhì)粒，然后用LT1轉染試劑將人D5受體cDNA轉染到H9C2細胞(H9C2-hD5WT和H9C2-hD5F173L)。用免疫印跡檢測轉染細胞內(nèi)His/V5的表達確定轉染是否成功。

1.4超聲檢查

使用VisualSonics，Vevo770(加拿大)，高分辨率小動物超聲系統(tǒng)，將3月齡的陽性轉基因小鼠及同齡野生型對照小鼠腹腔注射三溴乙醇(0.18 mL/10 g體重，250 mg/kg)麻醉。待小鼠麻醉完成后，用脫毛膏涂于左胸，靜待1 min，用衛(wèi)生紙將毛擦去。毛脫不凈影響超聲的清晰度。固定小鼠仰臥位，用醫(yī)用膠條將四肢固定于導電塊上，在4個導電塊涂上導電膠，用于分析心電圖、心率及呼吸等參數(shù)。胸部涂上耦合劑，超聲檢測。

1.5NADPH氧化酶活性測定

用二氯熒光素醋酸鹽(2′,7′- dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFDA)熒光法測定分別轉染了人多巴胺D5受體突變基因F173L和正常人多巴胺D5受體基因的大鼠心肌細胞(H9C2)NADPH氧化酶的活性。將H9C2細胞培養(yǎng)于96孔板中，先使用NADPH氧化酶的抑制劑二苯基碘(DPI，10 mmol/L/30 min)(Sigma)處理，用Hanks平衡鹽溶液洗滌一次，然后加入DCFDA(10 mmol/L)， 37℃，孵育30 min；用酶標儀(Sigma)在激發(fā)光485 nm和射出光530 nm波長的情況記錄熒光強度。小鼠心臟組織的NADPH 氧化酶的活性是利用光澤精化學發(fā)光法(lucigenin chemiluminescence)測定[17]。

1.6免疫印跡

提取小鼠心臟和轉染人D5受體的大鼠心肌細胞(H9C2)全蛋白，通過免疫印跡的方法檢測Nox2 (1:500，Epitomics)[20]，并以GAPDH作為參照內(nèi)參。

1.7統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計軟件處理，計量數(shù)據(jù)以平均值±標準誤(X±SE)的形式表示，二組樣本間的比較用t 檢驗，3 組及以上樣本的比較用One -Way ANOVA 統(tǒng)計分析方法，以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1α-MHC-hD5F173L和α-MHC-hD5WT轉基因小鼠心臟內(nèi)NADPH氧化酶活性和蛋白表達水平

分別利用光澤精化學發(fā)光法和免疫印跡方法檢測轉基因小鼠心臟內(nèi)NADPH氧化酶的活性及其NOX2蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)心臟特異表達人D5受體基因突變α-MHC-hD5F173L轉基因小鼠的NADPH氧化酶的活性和NOX2蛋白的表達均明顯高于野生型α-MHC-hD5WT 小鼠(圖1A, 1B).

圖1　α-MHC-hD5F173L和α-MHC-hD5WT轉基因小鼠心臟NADPH氧化酶活性及NOX2蛋白的表達水平 (*P < 0.05 vs. α-MHC-hD5WT，n=12)Fig.1　NADPH oxidase activity and NOX2 expression in the heart of α-MHC-hD5F173L and α-MHC-hD5WT mice (*P < 0.05 vs. α-MHC-hD5WT，n=12)

2.2Apocynin作用于α-MHC-hD5FL173L轉基因小鼠后心臟結構和功能的變化

我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，α-MHC-hD5FL173L轉基因小鼠心臟收縮期和舒張期左室內(nèi)徑均增加，收縮期和舒張期容積顯著增大，射血分數(shù)及短軸縮短率減少。病理學觀察顯示心腔明顯大于野生型，心室壁明顯變薄，心肌細胞不均勻肥大，心肌間質(zhì)纖維增多[19]。因此，我們使用NADPH氧化酶特異性抑制劑Apocynin (1 mmol/kg/day)，通過皮下持續(xù)給以α-MHC-hD5FL173L轉基因小鼠4周，發(fā)現(xiàn)Apocynin給藥組小鼠心臟擴張明顯改善(圖2)，心臟收縮期和舒張期容積減小(圖3A)，收縮期和舒張期左室內(nèi)徑減小(圖3B)，心臟體積相對減小(圖3C)，射血分數(shù)及短軸縮短率增加(圖3D，3E)，即心臟功能改善。

圖2　α-MHC-hD5FL173L轉基因小鼠分別注射生理鹽水和羅布麻寧后心臟的M超聲分析Fig.2　M-mode echocardiography of α-MHC-hD5FL173L mice heart injected with saline and Apocynin

圖3　A-E：α-MHC-hD5FL173L轉基因小鼠心臟功能的超聲心電圖分析(*P < 0.05 vs. saline treatment，n=10)Fig.3　A-E: Echocardiographic analysis of α-MHC-hD5FL173L mice cardiac function(*P < 0.05 vs. saline treatment，n=10)

圖4　H9C2-hD5F173L和H9C2-hD5WT細胞內(nèi)NADPH氧化酶的活性和NOX2蛋白的表達(*P < 0.05 vs.H9C2-D5WT，n=5) Fig.4　NADPH oxidase activity and NOX2 expression in H9C2-hD5F173L and H9C2-hD5WT cells (*P < 0.05 vs.H9C2-D5WT，n=5)

2.3H9C2-hD5F173L和H9C2-hD5WT細胞內(nèi)NADPH氧化酶的活性和蛋白的表達水平

為了進一步驗證多巴胺D5受體在心臟內(nèi)對氧化應激的調(diào)解作用，我們將hD5F173L和hD5WT轉染到H9C2細胞內(nèi)。因D5受體具有持續(xù)活性的特點，即D5受體在沒有多巴胺或激動劑作用的情況下仍具有功能活性[17]。因此，我們檢測了轉染細胞基礎條件下NADPH氧化酶的活性和蛋白表達。研究發(fā)現(xiàn)，H9C2-hD5F173L細胞內(nèi)NADPH氧化酶的活性和NOX2蛋白的表達均高于H9C2-hD5WT細胞(圖4A，4B)。

3討論

研究發(fā)現(xiàn)，轉人多巴胺D5受體突變基因hD5F175L心臟特異表達小鼠出現(xiàn)擴張型心肌病表型，心臟功能減弱，同時伴有心臟NADPH氧化酶活性和蛋白的表達增加。NADPH氧化酶抑制劑減輕了該疾病表型，改善了心臟功能。轉染hD5F173L基因的心肌細胞，在基礎狀態(tài)下，其NADPH氧化酶活性和蛋白的表達均顯著高于轉染正常hD5WT基因的細胞。一些臨床數(shù)據(jù)表明抗氧化劑對于擴張型心肌病的治療是有效的，如輔酶Q10、洋地黃、卡維地洛等[21-24]。因此可證明多巴胺D5 受體通過調(diào)節(jié)NADPH氧化酶的活性及ROS的產(chǎn)生來影響心臟的結構和功能。

臨床研究表明ROS的產(chǎn)生在許多心臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[25-26]。ROS包括含氧自由基、氧的非自由基衍生物、對氧化物、氫過氧化物、脂質(zhì)過氧化物等[27]。生理情況下，化學及代謝來源的ROS對機體起到有益作用，但在電離輻射、紫外線照射或抗氧化能力降低的情況下，機體內(nèi)將產(chǎn)生大量的ROS自由基及脂質(zhì)過氧化物等，使體內(nèi)氧化和抗氧化平衡失調(diào)，導致ROS連鎖反應，引起不同程度細胞毒性反應，并造成膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的氧化損傷，進而引起心肌細胞的凋亡、衰老以致心力衰竭的發(fā)生。NADPH氧化酶家族是心血管系統(tǒng)ROS的主要來源，NOX2在小鼠和人的心臟衰竭進展中起到了一定的促進作用，減少NOX2的表達能防止氧化應激而保護心肌細胞[19]。

研究表明，心肌中的NADPH氧化酶是產(chǎn)生ROS的主要來源，ROS可激活一系列下游信號，對細胞外因子產(chǎn)生應答。其介導的信號通路包括：1)ROS-MAPKs信號通路。在哺乳類動物細胞內(nèi)主要存在三條并行的MAPKs信號通路，即ERK(extracellularsignal-regulated kinase)、JNK/SAPK、p38MAPK。MAPK被雙重特異性激酶激活后從胞漿移行至胞核，進而活化調(diào)控肥厚基因(ANP、BNP、α-SKA、?-MHC)表達的轉錄因子[28]。研究發(fā)現(xiàn)，ROS是激活MAPKs重要的激活劑，心臟中ROS水平被抑制后，包括ERK1/2，JNK，P38在內(nèi)的MAPKs磷酸化化水平明顯下降，心肌肥厚減弱[29-30]。2)ROS-Ca2+信號通路。Ca2+是胞內(nèi)重要的第二信使，參與下游多條信號通路，在細胞信號傳導過程中起到重要的作用。ROS直接作用于鈉鈣交換蛋白，使得Ca2+大量內(nèi)流，激活胞核基因進一步增加胞質(zhì)蛋白的合成，導致心肌肥大[31-32]。但是，多巴胺D5受體并非是影響ROS產(chǎn)生的唯一通路，其調(diào)節(jié)心肌肥大的具體信號通路及作用機制還有待于進一步研究。

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〔修回日期〕2015-04-08

研究報告

The regulation of dilated cardiomyopathy by dopamine D5

receptor through inhibiting oxidative stress

WANG Zi-hao，HU Yong-yan，WANG Wen-jie，DONG Wei，JIANG Xiao-liang，LIU Xing，YANG Zhi-wei

(Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences &

Peking Union Medical College, Beijing 100021,China)

【Abstract】ObjectiveTo determine whether dopamine D5 receptor (D5R) regulates the development of dilated cardiomyopathy (DCM) by inhibiting oxidative stress. Methods We developed heart-specific hD5 mutant (α-MHC-hD5F173L) and wild type (α-MHC-hD5WT) transgenic mice. The NOX2 expression and ROS production were tested in the transgenic mice at three month of age. The α-MHC-hD5F173L mice were treated with either NADPH oxidase inhibitor Apocynin (1mmol/kg/day) or phosphate-buffered saline (PBS) as control by intraperitoneal injection for 4 weeks. After then, the indexes of heart function were measured. The hD5WT and hD5F173L were transfected respectively in rat H9C2 cells, in which ROS production and NOX2 expression were detected at basal level. ResultsThe ROS production and NOX2 expression were higher in the heart of α-MHC-hD5F173L than α-MHC-hD5WT mice. Apocynin treatment improved the heart function of α-MHC-hD5F173L mice. NOX2 expression and ROS production were higher in hD5F173L than hD5WT transfected H9C2 cells. ConclusionsDopomine D5 receptor may prevent DCM development by inhibiting oxidative stress.

【Key words】Dilated cardiomyopathy；Dopamine D5 receptor(D5R)；Reactive oxygen species(ROS)

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.006

【中圖分類號】R332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 05-0024-06

[通訊作者]楊志偉(1969-), 男，博士，研究員。 E-mail： yangzhiwei@cnilas.pumc.edu.cn。

[作者簡介]王子皓(1988-)，男，研究方向：高血壓的發(fā)病機制。E-mail： simmons224@sina.com。

[基金項目]2009國家自然科學基金面上項目(30971186)。