易宏淦，臧夢(mèng)雅，吳志遠(yuǎn)，朱　正，趙新明，王維虎，曲春楓

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣州　510182；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　100021；

3. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院影像診斷科，北京　100021；4. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院放射治療科，北京　100021)

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慢性腸道炎癥促進(jìn)肝癌的發(fā)展

易宏淦1,2，臧夢(mèng)雅2，吳志遠(yuǎn)2，朱正3，趙新明3，王維虎4，曲春楓2

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣州510182；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100021；

3. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院影像診斷科，北京100021；4. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院放射治療科，北京100021)

【摘要】目的探討慢性腸道炎癥狀態(tài)下菌群結(jié)構(gòu)及構(gòu)成改變對(duì)肝癌進(jìn)展的影響。 方法 22只雄性乙肝病毒轉(zhuǎn)基因小鼠在出生后第2周腹腔注射二乙基亞硝胺誘導(dǎo)小鼠原發(fā)性肝癌，隨機(jī)分為慢性腸炎組(給予含2%葡聚糖硫酸鈉的飲用水)和對(duì)照組(給予正常飲用水)。上述小鼠觀察至22周齡。在此期間定期進(jìn)行肝功能測(cè)定，收集糞便進(jìn)行宏基因組測(cè)序。另將4只已發(fā)生肝癌的小鼠與7只8周齡肉眼及病理學(xué)未見肝癌的小鼠同籠(分2籠)飼養(yǎng)16周。 結(jié)果 DSS所誘導(dǎo)的慢性腸炎小鼠與正常飲用水小鼠相比肝功能無顯著改變；DSS誘導(dǎo)的慢性腸炎組小鼠(n=10)在第22周齡時(shí)有9只發(fā)生彌漫性肉眼可見的肝癌，而正常飲用水小鼠(n=12)僅有2只發(fā)生肝癌，腫瘤發(fā)生率(P=0.002)和腫瘤數(shù)量(P=0.028)有顯著差別；與正常飲用水小鼠相比，慢性腸炎組小鼠腸道菌群中，普雷沃氏菌屬(P=0.022)和厭氧支原體屬(P=0.014)顯著減少；與已發(fā)生肝癌小鼠進(jìn)行同籠飼養(yǎng)的小鼠(n=7)在24周齡時(shí)全部發(fā)生肉眼可見的肝癌。 結(jié)論 慢性腸道炎癥狀態(tài)下，腸道菌群改變可促進(jìn)肝癌進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】慢性腸道炎癥；肝癌；菌群改變

Chronic colitis induced by irritant dextran sodium sulphate

原發(fā)性肝癌(primary carcinoma of the liver，HCC)是世界范圍內(nèi)第三大惡性腫瘤。在我國(guó)，慢性乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是肝癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素，生活環(huán)境的多種因素也影響著肝癌的發(fā)生發(fā)展[1-2]。近年來，歐美等國(guó)家的肝癌發(fā)病呈上升趨勢(shì)，然而，亞洲包括我國(guó)的肝癌發(fā)病則呈下降趨勢(shì)[3]，有些臨床的觀察流行病學(xué)研究指出：這種肝癌的下降趨勢(shì)與控制嬰幼兒的慢性HBV感染相關(guān)[4-6]。毫無疑問，控制慢性HBV感染能夠顯著降低青少年肝癌以及其它肝病的發(fā)生[7]，然而，我們以及其他研究者在江蘇啟東肝癌高發(fā)區(qū)現(xiàn)場(chǎng)人群中的研究表明，通過改善慢性HBV感染者的飲食結(jié)構(gòu)及飲水水質(zhì)，低年齡人群中肝癌發(fā)病率顯著降低[8-9]。

飲食結(jié)構(gòu)影響著腸道微生物種類及構(gòu)成，由于肝臟與腸道的特殊解剖關(guān)系，肝臟經(jīng)常接受來自腸道的多種抗原如細(xì)菌及其產(chǎn)物的刺激，在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，腸道的慢性炎癥性疾病常伴有多個(gè)器官受累的腸外表現(xiàn)，肝膽系統(tǒng)是腸外病變所主要累及的器官[10]。腸道炎癥常伴隨腸道菌群紊亂，并隨門靜脈遷移至肝臟引起肝臟病變，表明腸道微環(huán)境中的協(xié)同因素將有可能影響著肝癌的發(fā)展進(jìn)程，然而目前尚無直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

二乙基亞硝胺(diethylnirtosamine，DEN)是一種基因毒性肝臟致癌劑，在動(dòng)物研究中，常用DEN來誘導(dǎo)動(dòng)物的肝癌，以模擬人類肝癌發(fā)生過程[11-12]。1985年，Ohkusa等[13]報(bào)導(dǎo)了葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulphate，DSS)誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎，DSS結(jié)腸炎模型與人類炎癥性腸病特別是潰瘍性結(jié)腸炎的病理特征類似。本研究采用腹腔注射DEN在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)基因毒性以誘發(fā)原發(fā)性肝癌，通過給予含DSS飲用水造成慢性腸道炎癥，探討腸道慢性炎癥時(shí)腸道菌群改變對(duì)肝癌發(fā)展的作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無特定病原體級(jí)雄性HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，鼠齡6～8周，體重18～20 g，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(京)2011-0012】，自行繁殖并飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(京)2008-0025】。

1.1.2主要試劑

葡聚糖硫酸鈉(DSS)相對(duì)分子量為36 000 ～ 50 000，購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals公司。二乙基亞硝胺(DEN)粉末1 mg，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)購(gòu)自上海科華生物工程股份有限公司。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測(cè)定試劑盒(速率法)購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司。糞便基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。λ DNA/Hind Ⅲ(即用型0.1 mg DNA/mL)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2方法

1.2.1DEN誘導(dǎo)小鼠原發(fā)性肝癌

在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠在生后第2周按25 μg/g體重腹腔注射DEN，于小鼠5周齡時(shí)選擇雄性小鼠進(jìn)行尾靜脈采血，采用乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒以確定小鼠體內(nèi)存在乙型肝炎病毒表面抗原的持續(xù)表達(dá)。對(duì)于具有HBsAg持續(xù)表達(dá)的小鼠分別于小鼠第8周齡，14周齡和16周齡時(shí)，采用小鼠B超(visual sonics vevo770)進(jìn)行肝臟掃描，并選擇上述處理的5只小鼠，打開腹腔獲取肝臟組織再檢查是否存在肉眼可見肝臟結(jié)節(jié)，采用10%中性福爾馬林將肝葉組織固定，石蠟包埋后進(jìn)行組織切片，HE染色后顯微鏡下檢查肝癌發(fā)生情況。

1.2.2DSS誘導(dǎo)慢性結(jié)腸炎

在小鼠第8周齡時(shí)將22只小鼠隨機(jī)分成慢性腸炎組(n=10)和對(duì)照組(n=12)，對(duì)照組給予正常飲用水。慢性腸炎組在第8周齡給予含2%DSS的飲用水，持續(xù)5 d，隨后改用正常飲用水16 d，作為1個(gè)DSS周期，共給予4個(gè)DSS周期。

1.2.3糞便基因組提取

在第22周時(shí)，無菌條件下采集慢性腸炎組和對(duì)照組小鼠糞便，保存于-80℃。按照說明書操作提取糞便基因組DNA。應(yīng)用NanoDrop 2000C(Thermo Scientific)檢測(cè)提取的總DNA的濃度和純度，并采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定確定DNA的完整性。

1.2.4ALT測(cè)定

在每次給予DSS飲用水前后，尾靜脈采血，分離血清。按照丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒(速率法)說明書檢測(cè)血清中ALT水平。

1.2.5小鼠肝臟組織學(xué)分析

小鼠二氧化碳麻醉后，在肝臟病變最明顯處取1 cm×1 cm大小組織，固定于10%中性甲醛中，石蠟包埋切片后，進(jìn)行HE染色。

1.2.6混合飼養(yǎng)(Cohouse)

小鼠在2周齡時(shí)注射DEN，將已發(fā)生肝癌的26周齡小鼠(n=4)與8周齡的雄性鼠(n=7，)進(jìn)行混合飼養(yǎng)，共2籠：其中1籠包含2只已發(fā)生肝癌的小鼠和3只8周齡的雄性鼠，另1籠包含2只已發(fā)生肝癌的小鼠和4只8周齡的雄性鼠，共計(jì)16周。

1.2.7糞便微生物基因組測(cè)序

糞便基因組DNA在博奧生物有限公司擴(kuò)增16S V4區(qū)，采用Ion Torrent平臺(tái)進(jìn)行宏基因組測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括群落結(jié)構(gòu)分析，顯著差異性分析等。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1小鼠血清ALT的變化

DSS是一種腸道刺激物可導(dǎo)致小鼠腸炎，但不能進(jìn)入血液，為排除其對(duì)肝細(xì)胞的直接損傷作用，通過血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的測(cè)定，對(duì)照組和慢性腸炎組小鼠血清中ALT水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1)，表明DSS沒有直接引起肝細(xì)胞損傷。

圖1　小鼠血清ALTFig.1　The level of ALT in serum

2.2小鼠肝臟腫瘤進(jìn)展的改變

通過飲用DSS導(dǎo)致的慢性腸炎小鼠(n=10)在22周齡時(shí)有9只發(fā)生彌漫性的肉眼可見的肝癌，肝癌發(fā)生率為90.0%(9/10)，光鏡下可見邊界清晰的癌灶，瘤細(xì)胞間有豐富的血竇樣間隙；對(duì)照組(n=12)小鼠僅有2只發(fā)生肝癌，發(fā)生率為16.7%(2/12)，兩組肝癌發(fā)生率有顯著差別(P=0.002)。在已發(fā)生腫瘤的小鼠中，計(jì)數(shù)腫瘤數(shù)量，相較于對(duì)照組，慢性腸炎組小鼠肝臟腫瘤的數(shù)量明顯增多(P=0.028)(封2圖2)。該結(jié)果表明DSS通過誘導(dǎo)慢性結(jié)腸炎癥的發(fā)生促進(jìn)了肝癌的發(fā)展。

2.3小鼠腸道菌群改變

小鼠糞便微生物宏基因組測(cè)序結(jié)果顯示，與HBV/DEN對(duì)照組(n=5)相比較，在DSS誘導(dǎo)慢性結(jié)腸炎組(n=3)中腸道菌群發(fā)生了明顯的改變，其中普雷沃氏菌屬(P=0.022)和厭氧支原體屬(P=0.014)顯著減少(彩插1圖3)，該結(jié)果表明DSS通過誘導(dǎo)結(jié)腸炎癥的發(fā)生導(dǎo)致了腸道菌群的改變。

2.4混合飼養(yǎng)(Cohouse)影響肝癌進(jìn)展

我們將已發(fā)生肝癌小鼠(n=4)與8周齡大小DEN處理的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠(n=7，肉眼及病理學(xué)未見肝癌)混合飼養(yǎng)(Cohouse)來改變腸道菌群，在第24周齡時(shí)全部小鼠發(fā)生肉眼可見的肝癌(封2圖4)。

3討論

肝臟是人體最大的實(shí)質(zhì)性器官，有雙重血液供應(yīng)：肝動(dòng)脈內(nèi)是來自心臟的動(dòng)脈血；門靜脈收集消化道的靜脈血。肝臟大約70%的血液來自門靜脈。因此，肝臟經(jīng)常接受來自腸道的抗原刺激，包括食物源性抗原和細(xì)菌相關(guān)抗原。腸道細(xì)菌在腸-肝軸中發(fā)揮重要作用。人體腸道中的細(xì)菌數(shù)(1×1013)大約是人體細(xì)胞數(shù)(1×1012)的10倍[14-15]。腸道細(xì)菌參與宿主的正常生理活動(dòng)，包括營(yíng)養(yǎng)、行為和應(yīng)激反應(yīng)。作為共生菌，這些微生物在人體消化吸收過程中起關(guān)鍵作用，腸道細(xì)菌通過活化或競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制阻止外來病原菌的入侵，當(dāng)菌群穩(wěn)態(tài)被打破時(shí)，腸道細(xì)菌通過影響附近和遠(yuǎn)端臟器，在疾病發(fā)生中起重要作用，此外，腸道細(xì)菌也能促進(jìn)腸上皮細(xì)胞分化增殖，在維持腸道屏障功能中起關(guān)鍵作用[16]。

持續(xù)存在的慢性炎癥在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用，在人群中的研究發(fā)現(xiàn)，腸道細(xì)菌可以影響腸外腫瘤包括肝癌和乳腺癌的發(fā)展[17]，腸道菌群易位能促進(jìn)肝纖維化發(fā)生[18]。在肝癌的發(fā)生和化學(xué)劑誘導(dǎo)的炎性腫瘤中，腸道穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用，Dianne H. Dapito等[19]研究表明，腸道微生物可能通過TLR4促進(jìn)肝癌發(fā)生。本研究中，我們利用DEN誘發(fā)小鼠原發(fā)性肝癌，同時(shí)利用DSS誘導(dǎo)小鼠慢性結(jié)腸炎，結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性腸道炎癥能促進(jìn)肝癌的進(jìn)展。利用宏基因組測(cè)序方法檢測(cè)小鼠糞便細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)在慢性腸道炎癥存在下，腸道細(xì)菌有明顯改變，其中普雷沃氏菌屬和厭氧支原體屬顯著減少。同時(shí)，鑒于鼠類是嗜糞動(dòng)物(coprophaga)[20]，我們將已發(fā)生肝癌小鼠與肉眼及病理未見肝癌小鼠同籠飼養(yǎng)(Cohouse)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cohouse能促進(jìn)肝癌的進(jìn)展，具體原因還需進(jìn)一步研究，根據(jù)Damman等[21]研究報(bào)道，我們推測(cè)Cohouse可能改變了腸道菌群，但還需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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〔修回日期〕2015-03-31

研究報(bào)告

promote hepatoma development in mice

YI Hong-gan1,2，ZANG Meng-ya2，WU Zhi-yuan2，

ZHU Zheng3，ZHAO Xin-ming3，WANG Wei-hu4，QU Chun-feng2

(1. Guangzhou Medical University, Guangzhou 510182, China; 2.State Key Lab of Molecular Oncology, Beijing 100021,China;

3. Department of Medical Imaging, Beijing 100021,China; 4. Department of Radiation Oncology, Cancer Institute/Hospital,

Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100021, China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of gut bacteria under chronic colitis on the progression of hepatoma in mice. Methods 22 hepatitis B virus (HBV)-transgenic mice (male, 8 weeks) were randomly divided into two groups, one group (n=10) was fed the drinking water containing 2% dextran sodium sulphate(DSS)to induce chronic colitis and the control group(n=12)was fed with normal drinking water. In order to investigate the effect of gut microbes,7 male HBV-transgenic mice(8 weeks, with no detectable hepatoma under microscopy) were cohoused with 4 mice with hepatoma for 16 weeks. ResultsNo significant liver cell damage was observed in the group of the mice fed with 2% DSS-containing drinking water. By the 22-week old,9 of the 10 mice(90.0%) fed with 2% DSS-containing drinking water, 2 of the 12 mice(16.7%) fed with normal drinking had hepatoma. Both the hepatoma incidence and the tumor numbers in the group of mice fed with DSS-containing water were significantly higher than that in the controls (P=0.002 and P=0.028respetively). Compared to controls, the bacteria family Prevotella (P=0.022) and Anaeroplasma (P=0.014) reduced significantly in the mice with induced chronic colitis. All the mice (n=7) cohoused with the mice with hepatoma had the liver tumor developed at 24-week-old. Conclusion Alterations of gut bacteria under chronic colitis may promote the development of liver cancer.

【Key words】Chronic colitis；Liver cancer；Gut bacteria

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.001

【中圖分類號(hào)】R332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2015) 05-0001-04

[通訊作者]曲春楓，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： quchf@cicams.ac.cn。

[作者簡(jiǎn)介]易宏淦(1989-)，男，碩士生，研究方向：慢性炎癥與腫瘤免疫。

[基金項(xiàng)目]973課題“細(xì)胞微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制”(2011CB504205)。