陳　敏，　張明升△，　張軒萍，　梁月琴

(山西醫(yī)科大學(xué) 1藥理學(xué)教研室， 2機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030001)

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肢體缺血預(yù)適應(yīng)減輕人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷*

陳敏1，張明升1△，張軒萍1，梁月琴2

(山西醫(yī)科大學(xué)1藥理學(xué)教研室，2機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030001)

[摘要]目的： 探討肢體缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激損傷的血管內(nèi)皮是否具有保護(hù)作用。方法: 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分為5組：對(duì)照組不加任何處理；模型組給予過(guò)氧化氫損傷2 h；早期肢體缺血預(yù)適應(yīng)組、晚期肢體缺血預(yù)適應(yīng)組和假肢體缺血預(yù)適組這3組分別用5%大鼠早期肢體缺血預(yù)適應(yīng)血清、晚期肢體缺血預(yù)適應(yīng)血清和假肢體缺血預(yù)適應(yīng)血清孵育12 h，再用過(guò)氧化氫損傷2 h。檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶的活性，內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子的mRNA水平，血紅素氧合酶1的mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果: 大鼠早期肢體缺血預(yù)適應(yīng)和晚期缺血預(yù)適應(yīng)血清可以減輕人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，減少乳酸脫氫酶的釋放，減少內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，并能增加血紅素氧合酶1的mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)論: 肢體缺血預(yù)適應(yīng)可以減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

[關(guān)鍵詞]肢體缺血預(yù)適應(yīng)； 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞； 氧化應(yīng)激

血管內(nèi)皮細(xì)胞是緊貼血管內(nèi)表面的單層細(xì)胞，最初認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞只是起簡(jiǎn)單的屏障作用，將血液與血管壁的其它組織分隔開(kāi)。隨著研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞是人體最大的腺體[1]，通過(guò)產(chǎn)生各種血管活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)血管的張力、血小板的活化、白細(xì)胞的黏附等，對(duì)維持血管穩(wěn)態(tài)起重要作用[2]。當(dāng)器官發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞首當(dāng)其沖受到影響，而內(nèi)皮功能的好壞又直接影響到器官的血液灌注和供氧，因此減輕血管內(nèi)皮損傷也是減輕器官損傷的重要環(huán)節(jié)。

肢體缺血預(yù)適應(yīng)(limb ischemic preconditioning，LIPC)不僅可以減輕心、腦等重要臟器的缺血再灌注損傷[3-4]，LIPC還可以改善正常人的血管內(nèi)皮功能[5]，減輕經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療患者的血管內(nèi)皮損傷[6]。臨床研究中，采用血流介導(dǎo)的舒張功能(flow-mediated dilation，F(xiàn)MD)評(píng)價(jià)血管內(nèi)皮功能，指標(biāo)單一，缺乏全面詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，并用H2O2制造穩(wěn)定的氧化應(yīng)激損傷模型，采集大鼠LIPC的早期缺血預(yù)適應(yīng)血清和晚期缺血預(yù)適應(yīng)血清來(lái)觀察LIPC是否可以減輕內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，并初步探討機(jī)制。

材料和方法

1動(dòng)物、細(xì)胞和試劑

雄性SD大鼠，體重220～250 g，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK (晉) 2009-0001。飼養(yǎng)溫度(22±2) ℃，相對(duì)濕度50%～60%，自由飲水及攝食。正常喂養(yǎng)2周后，將大鼠隨機(jī)分為3組，每組5只。早期肢體缺血預(yù)適應(yīng)組(early limb ischemic preconditioning，EPC)，晚期肢體缺血預(yù)適應(yīng)組(delayed ischemic preconditioning，DPC)，假肢體缺血預(yù)適應(yīng)組(sham ischemic preconditioning，SPC)。

HUVECs購(gòu)自上海細(xì)胞所。用DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone)加10%的胎牛血清(杭州四季青)常規(guī)培養(yǎng)，2～3 d換液 1 次，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)，0.25%胰酶(北京索萊寶)消化傳代。

細(xì)胞總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑及熒光定量PCR試劑購(gòu)自TaKaRa；引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成；血紅素氧合酶1 (heme oxyge-nase-1，HO-1)抗體購(gòu)自Abcam；乳酸脫氫酶(laetate dehydrogenase， LDH)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程有限公司；流式雙染試劑盒購(gòu)自南京凱基生物發(fā)展有限公司。

2方法

2.1大鼠肢體缺血預(yù)適應(yīng)方法及血清的獲取用改良的血壓計(jì)套環(huán)套在大鼠右后肢，充氣加壓至200 mmHg，阻斷大鼠右后肢血流，大鼠右后肢發(fā)紫，足背動(dòng)脈搏動(dòng)消失，造成后肢缺血，持續(xù)加壓5 min。隨后放氣減壓，大鼠右后肢恢復(fù)正常顏色，足背動(dòng)脈搏動(dòng)出現(xiàn)，右后肢血流恢復(fù)，右后肢再灌注，持續(xù)10 min[7-8]。重復(fù)3個(gè)循環(huán)。假肢體預(yù)適應(yīng)組大鼠只將右后肢放入套環(huán)，并不充氣加壓阻斷血流。

大鼠麻醉(25%烏拉坦，腹腔注射，1 g/kg)后，腹主動(dòng)脈無(wú)菌采血，4 ℃靜置30 min，3 000 r/min離心15 min，分離得血清，無(wú)菌分裝后，置于-80 ℃保存。LIPC后1 h內(nèi)采血，得到血清為早期肢體缺血預(yù)適應(yīng)血清(early limb ischemic preconditioning serum，EPS)，LIPC后24 h采血，得到晚期肢體缺血預(yù)適應(yīng)血清(delayed limb ischemic preconditioning serum，DPS)。

2.2細(xì)胞分組HUVECs分為5組：正常對(duì)照組(control，C)，常規(guī)培養(yǎng)，不加任何處理措施；模型組(model，M)，用1 mmol/L的H2O2處理2 h；EPS組,用5%的EPS預(yù)孵育12 h，再用1 mmol/L的H2O2處理2 h；DPS組,用5%的DPS預(yù)孵育12 h，再用1 mmol/L的H2O2處理2 h；SPS組，用5%的SPS預(yù)孵育12 h，再用1 mmol/L的H2O2處理2 h。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞處理結(jié)束后，用PBS清洗，胰酶消化，收集，離心后用Annexin V-FITC結(jié)合液重懸制成細(xì)胞懸液，加入Annexin V-FITC和PI室溫避光孵育10 min后上機(jī)檢測(cè)。

2.4細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH活性的測(cè)定各組細(xì)胞處理結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，1 000 r/min，離心5 min棄去沉淀，用試劑盒檢測(cè)LDH的活性。

2.5細(xì)胞總RNA的提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)按照試劑說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定18 s和28 s的完整性，用分光光度計(jì)定量，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)得到cDNA。取一定量的cDNA按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。所用引物如表1所示。設(shè)定反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s ；95 ℃ 30 s。反應(yīng)結(jié)束，根據(jù)熒光反應(yīng)的閾值，得到Ct值，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1　引物序列

2.6Western blot實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，各種處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗2遍，加入含有PMSF的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，(10 000～14 000)×g離心15 min，取上清，分裝于-80 ℃保存。BCA定量后，取50 μg的總蛋白上樣電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉， I抗4 ℃孵育過(guò)夜， II抗孵育2～3 h，ECL曝光，底片拍照，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度。用目的蛋白/β-actin的比值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異的比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用 Bonferroni 法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

HUVECs各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)處理后，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。M組的早期凋亡率、晚期凋亡率和總的死亡率與C組相比均顯著增高(P<0.01)，這表明1 mmol/L H2O2孵育2 h可以引起細(xì)胞損傷，模型構(gòu)建成功。如果用5% EPS和DPS 提前孵育12 h，則細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和總的死亡率顯著降低(P<0.01)，而SPS組早期凋亡率、晚期凋亡率和總的死亡率與M組相比，無(wú)顯著差異。

Figure 1.The cell viability of HUVECs in all groups analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsM.

圖1流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞凋亡

2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH的活性

HUVECs細(xì)胞用1 mmol/L的H2O2處理2 h，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的LDH活性顯著升高(P<0.01)。與M組相比，用5%的EPS和DPS預(yù)孵12 h，上清液中LDH的活性顯著降低(P<0.01)。SPS組與M組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3黏附分子的表達(dá)

經(jīng)過(guò)1 mmol/L H2O2處理 2 h，與對(duì)照組相比，M組的ICAM-1和VCAM-1 mRNA的量增加，用EPS和DPS預(yù)處理的細(xì)胞ICAM-1和VCAM-1 mRNA的量減少。SPS組與M組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4HO-1的mRNA和蛋白水平

通過(guò)熒光定量PCR的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)EPS和DPS處理的細(xì)胞，HO-1的mRNA與M組相比，顯著增高(P<0.01)，而SPS組與M組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與M組相比，EPS和DPS組細(xì)胞HO-1蛋白的表達(dá)量增高(P<0.05)，而SPS組HO-1蛋白表達(dá)與M組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4。

Figure 2.The activity of LDH in culture medium of all groups. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsM.

圖2各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的活性

Figure 3.The mRNA levels of VCAM-1 and ICAM-1 detected by real-time PCR. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsM.

圖3各組細(xì)胞黏附分子的mRNA 水平

討論

本實(shí)驗(yàn)中用1 mmol/L的H2O2損傷2 h發(fā)現(xiàn)，HUVECs細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡及壞死的細(xì)胞增多，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH的含量也明顯增加，HUVECs細(xì)胞損傷嚴(yán)重。將EPS和DPS加入HUVECs預(yù)孵12 h，可以明顯減輕H2O2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，凋亡和壞死的細(xì)胞減少，LDH的釋放減少，這表明肢體缺血預(yù)適應(yīng)可以減輕內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，單核細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生過(guò)程的初始因素。在此過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附分子起重要作用。內(nèi)皮損傷內(nèi)皮功能障礙時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附分子表達(dá)增加[9]。本實(shí)驗(yàn)用1 mmol/L的H2O2損傷HUVECs，血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附分子ICAM-1和VCAM-1的mRNA水平顯著增加，而EPS和DPS處理后，血管內(nèi)皮細(xì)胞的ICAM-1和VCAM-1的mRNA降低，這表明LIPC可以減少血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，有助于減輕動(dòng)脈粥樣硬化。

Figure 4.The expression of HO-1 at mRNA and protein levels. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsM.

圖4各組細(xì)胞HO-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平

HO-1是一個(gè)內(nèi)源性的保護(hù)酶，能夠被氧化應(yīng)激誘導(dǎo)表達(dá)增多[10]。HO-1的主要功能是催化血紅素生成一氧化碳、鐵離子和膽紅素[11]。現(xiàn)在的研究證實(shí)HO-1可以抗氧化應(yīng)激，產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)，能夠減輕血管的重構(gòu)和動(dòng)脈粥樣硬化的形成[12-13]，是治療血管疾病的一個(gè)重要靶點(diǎn)。HO-1還能夠減輕多種因素，如吸煙[14]、PM2.5[15]所導(dǎo)致的內(nèi)皮損傷。在本研究中，EPS和DPS預(yù)孵后能夠誘導(dǎo)HUVECs表達(dá)HO-1，肢體缺血預(yù)適應(yīng)可能通過(guò)誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)而減輕過(guò)氧化氫造成的氧化應(yīng)激損傷。

至今為止，肢體缺血預(yù)適應(yīng)的機(jī)制并不完全清楚。目前有3個(gè)假設(shè)用來(lái)解釋LIPC的保護(hù)作用：第一是肢體缺血預(yù)適應(yīng)觸發(fā)某些物質(zhì)釋放入血液，經(jīng)血流到達(dá)靶器官發(fā)揮保護(hù)作用；第二是LIPC刺激后，神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)靶器官產(chǎn)生保護(hù)作用[16]，神經(jīng)系統(tǒng)參與了LIPC過(guò)程；第三是LIPC觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)抗炎和抗凋亡作用[17]。LIPC后，血液中成分確實(shí)發(fā)生了改變，如健康成人的上肢進(jìn)行缺血預(yù)適應(yīng)后，血液中有51種蛋白質(zhì)發(fā)生變化，這些蛋白質(zhì)涉及免疫反應(yīng)，離子結(jié)合，滲透壓維持及氧化應(yīng)激反應(yīng)等方面[18]。人類LIPC后血液中產(chǎn)生的這些物質(zhì)甚至可以對(duì)兔心臟產(chǎn)生保護(hù)作用，這意味著LIPC存在種屬交叉[19]。大鼠經(jīng)過(guò)肢體缺血預(yù)適應(yīng)之后，血漿中有7種蛋白發(fā)生改變，這些蛋白早已被證實(shí)參與器官保護(hù)、抗炎和抗缺血[20]。本研究則發(fā)現(xiàn)大鼠LIPC后的血清可以減輕人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)一步證實(shí)了LIPC所產(chǎn)生的保護(hù)性物質(zhì)在種屬間有交叉性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)肢體缺血預(yù)適應(yīng)通過(guò)誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)，從而減輕內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，減少黏附分子的表達(dá)。肢體缺血預(yù)適應(yīng)產(chǎn)生的保護(hù)物質(zhì)在種屬間有交叉。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

*[基金項(xiàng)目]深圳市重點(diǎn)資助科技計(jì)劃(No.201201022)

Limb ischemic preconditioning protects human umbilical vein endothelial cells from oxidative stress induced by H2O2CHEN Min1, ZHANG Ming-sheng1, ZHANG Xuan-ping1, LIANG Yue-qin2

(1DepartmentofPharmacology，2MedicalFunctionalExperimentalCenter,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:4156589@sina.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of the sera from the rats after limb ischemic preconditioning (LIPC) on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) injured by hydrogen peroxide (H2O2). METHODS: The HUVECs were divided into 5 groups: the cells in control group were cultured without any intervention; the cells in model group (M) were damaged by 1 mmol/L H2O2for 2 h; the cells in early preconditioning serum (EPS) group, delayed preconditioning serum (DPS) group or sham limb ischemic preconditioning serum (SPS) group were treated with the corresponding serum at 5% for 12 h, respectively, and then treaed with H2O2for 2 h. The viability of the HUVECs was analyzed by flow cytometry. The lactate dehydrogenase (LDH) in the culture media was detected. The cell adhesion molecules in the HUVECs were detected by real-time PCR. The mRNA and protein expression of heme oxygenase-1 (HO-1) was also determined. RESULTS: The viability of HUVECs incubated with 1 mmol/L H2O2for 2 h significantly decreased compared with the control cells, which was accompanied with the augmentations of LDH in the medium and the cell adhesion molecules in cells, such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1). Preincubation with EPS and DPS derived from the rats subjected LIPC attenuated these injuries. Furthermore, pretreatment with EPS and DPS increased the expression of HO-1 at mRNA and protein levels. CONCLUSION: LIPC protects the HUVECs from H2O2-induced injury.

[KEY WORDS]Limb ischemic preconditioning; Human umbilical vein endothelial cells; Oxidative stress

通訊作者△Tel: 0755- 22943200; E-mail: dsp66@medmail.com.cn

[收稿日期]2015- 06- 29[修回日期] 2015- 09- 22

[文章編號(hào)]1000- 4718(2015)12- 2282- 05

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.028

[中圖分類號(hào)]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A