·醫(yī)學(xué)簡(jiǎn)訊·

角蛋白網(wǎng)絡(luò)修飾導(dǎo)致毛囊纖維的機(jī)械性硬化

生物組織是具有顯著機(jī)械特性和彈性模量結(jié)構(gòu)的復(fù)合材料，其范圍從幾帕斯卡到幾千兆帕斯卡。有一個(gè)研究領(lǐng)域一直致力于從分子水平到細(xì)胞和組織水平上了解生物網(wǎng)絡(luò)的局部結(jié)構(gòu)和機(jī)械特性是如何界定其宏觀結(jié)構(gòu)的。該研究的一種挑戰(zhàn)是，這些網(wǎng)絡(luò)的特性必定在長(zhǎng)度和力度水平上數(shù)倍超越從整個(gè)組織水平轉(zhuǎn)換至細(xì)胞和分子水平（反之亦然）而來的宏觀機(jī)械力。

在細(xì)胞水平上，過去數(shù)十年見證了由角蛋白、微管和中間絲（IFs）組成的細(xì)胞骨架在如何決定細(xì)胞機(jī)械特性方面的長(zhǎng)足進(jìn)展。對(duì)分離細(xì)胞的體外研究和在可控性架構(gòu)和組成的基礎(chǔ)上對(duì)生物網(wǎng)絡(luò)的體外重組，提高人們對(duì)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)方面的認(rèn)識(shí)。然而，這些模型仍然只是近似于大多數(shù)組織復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。在組織水平上，結(jié)構(gòu)各向異性以及各種機(jī)械性能不同的成分通常會(huì)阻礙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與機(jī)械特性之間的直接相關(guān)性。分析模型和計(jì)算機(jī)模擬可從理論上將網(wǎng)絡(luò)的宏觀機(jī)械特性與局部網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的參數(shù)連接起來。

在此使用的人體毛囊，展示了三維組織中局部、微觀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)如何與局部機(jī)械特性相連接的一種模型系統(tǒng)。毛囊的硬度預(yù)計(jì)可呈數(shù)量級(jí)倍數(shù)的增強(qiáng)，這是由柔軟角質(zhì)形成細(xì)胞分化而來的毛發(fā)纖維，其楊氏模量在千兆帕斯卡范圍內(nèi)。在兩個(gè)極端之間，中間絲網(wǎng)絡(luò)的角化過程使各向同性的細(xì)胞基質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)槎栊郧腋飨虍愋缘奈镔|(zhì)，連接了從亞細(xì)胞水平到組織水平的長(zhǎng)度和力度。這種轉(zhuǎn)變與其他角化結(jié)構(gòu)（如甲和角）的形成以及角質(zhì)層（皮膚的最外側(cè)結(jié)構(gòu)）的形成具有相似性。其伴隨著多種生物學(xué)過程，如不同角蛋白和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白（KAPs）的特異性表達(dá)，連同角蛋白網(wǎng)絡(luò)的重組和水分丟失一起，導(dǎo)致纖維的壓縮和硬化。然而，盡管一些補(bǔ)充研究對(duì)伴隨的角化過程的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行了分析，但是對(duì)其機(jī)械性硬化的結(jié)果仍了解甚少。

為此，該研究使用原子力顯微鏡（AFM）沿著毛囊的軸線測(cè)量角蛋白結(jié)構(gòu)的硬化，并同時(shí)定量局部角蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和角蛋白超分子結(jié)構(gòu)。

一、材料和方法

詳見原文。

二、結(jié)果

毛囊機(jī)械力：對(duì)取自健康白種人完整毛囊的角蛋白網(wǎng)絡(luò)的硬化進(jìn)行定量。通過冷凍切片獲得縱切面為10 μm厚度的樣本，并將其吸附于載玻片上。為了模擬在體環(huán)境，必須保持高含量的水分以避免組織干燥和萎縮。因此，樣本切開后立即將切片浸沒于PBS溶液中。AFM檢查其具有半徑為納米范圍（r=20～60 nm）的尖端，因此可以對(duì)浸沒切片的機(jī)械特性進(jìn)行局部探查。該研究采用了力-容積模式，在10 μm×10 μm區(qū)域內(nèi)通過256等距曲線法記錄力和壓痕深度。使用Hertz模型計(jì)算相關(guān)彈性系數(shù)。注意，確定的絕對(duì)系數(shù)值取決于頂端的形狀和所用的擬合模型；尖端更適于探查深層纖維網(wǎng)絡(luò)的局部結(jié)構(gòu)。沿毛囊軸線記錄推算的彈性系數(shù)。一個(gè)10 μm×10 μm區(qū)域內(nèi)系數(shù)的離散度大是由樣品納米水平的不均一所致，提示所記錄的力壓痕曲線均值是局部毛囊機(jī)械力的代表性測(cè)量值

角化過程中網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變化：為了理解所觀察到的毛囊的宏觀硬化如何對(duì)應(yīng)其角蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的微觀變化，我們沿著毛囊的軸線記錄其縱切面的形貌學(xué)圖像（topographic image）。不同于透射電鏡（TEM）對(duì)超薄切片或染色的要求，AFM能夠直接記錄高分辨率的圖像。該圖像是使用AFM的峰值力定量納米結(jié)構(gòu)圖（QNM）模式獲得保留纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的干燥毛囊的形貌學(xué)圖。超過170 μm，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)隨角化進(jìn)程而發(fā)生變化：纖維變得更粗更直且結(jié)構(gòu)更緊密。TEM研究結(jié)果與此一致。

半胱氨酸交聯(lián)和（超）分子結(jié)構(gòu)對(duì)網(wǎng)絡(luò)機(jī)械性的影響：生物網(wǎng)絡(luò)的機(jī)械特性不僅由其幾何因素和纖維密度所決定，還取決于單個(gè)纖維的硬度。在距毛囊球部500 μm的硬度曲線拐點(diǎn)κ之上，纖維直徑和方向性的微觀網(wǎng)絡(luò)改變減慢。為了更好地了解在拐點(diǎn)κ之后仍然出現(xiàn)的彈性模量的顯著增加，該研究使用X射線微衍射對(duì)大纖絲（macrofibrils）的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。如上所述，分析了兩個(gè)毛囊間小角度和大角度X射線衍射（SAXS/WAXS）圖，并得出4個(gè)不同角質(zhì)化區(qū)的大致位置。比較同一供體毛囊的結(jié)構(gòu)圖顯示，Ⅰ區(qū)包含無方向性、無定形結(jié)構(gòu)，其發(fā)生5倍硬化。Ⅱ區(qū)和Ⅲ區(qū)顯示為IF形成、定向，之后縮合成網(wǎng)絡(luò)，分別對(duì)應(yīng)10倍增加的彈性模量。Ⅳ區(qū)出現(xiàn)極少的硬化，對(duì)應(yīng)IFs在大纖絲之內(nèi)的最后軸向重排。在分化毛發(fā)內(nèi)的角蛋白纖維含有大量的半胱氨酸殘基。其與富含半胱氨酸的KAPs一起確保了IFs的共價(jià)交聯(lián)。X射線衍射證實(shí)了晚期毛囊內(nèi)這種逐漸形成的角蛋白-KAPs二硫化物網(wǎng)絡(luò)的存在。這些結(jié)果表明，半胱氨酸形成和最終的軸向重排與其結(jié)構(gòu)的干燥共同導(dǎo)致了最終的硬化。

為了驗(yàn)證半胱氨酸交聯(lián)對(duì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響，在DTT還原反應(yīng)前、后分別探查毛囊的結(jié)構(gòu)。DTT是一種可以破壞半胱氨酸-二硫鍵的還原劑，AFM形貌圖像證實(shí)其可以造成大纖絲的膨脹。結(jié)果顯示添加DTT并不影響毛囊球部彈性模量的檢測(cè)。相反，DTT可以軟化分化毛發(fā)內(nèi)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。同一個(gè)體內(nèi)DTT處理前、后的系數(shù)比率顯示，半胱氨酸交聯(lián)對(duì)沿毛囊軸向的彈性模量的影響呈持續(xù)增加。

三、討論

該研究首次對(duì)毛囊內(nèi)整個(gè)角質(zhì)化進(jìn)程中毛發(fā)纖維的漸進(jìn)性硬化進(jìn)行檢測(cè)，并從機(jī)械測(cè)量的角度分析微觀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、局部角蛋白的超分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)事件所伴隨發(fā)生的變化。

該研究的AFM和TEM數(shù)據(jù)顯示，各向同性的中間絲（IF）網(wǎng)絡(luò)出現(xiàn)在真皮乳頭的上方，位于距毛囊基底部200 μm的伸長(zhǎng)區(qū)（Ⅰ區(qū)）內(nèi)。所觀察到的IF網(wǎng)絡(luò)的外觀與之前關(guān)于角蛋白如K35和K85形成的報(bào)告一致，Ⅰ區(qū)早期內(nèi)的高甘氨酸-酪氨酸和高硫KAPs且恰好位于真皮乳頭處。DTT還原實(shí)驗(yàn)顯示，半胱氨酸交聯(lián)在這一階段對(duì)其機(jī)械特性無顯著的促進(jìn)作用，進(jìn)而推測(cè)早期KAPs與角蛋白之間的異構(gòu)肽（γ-谷?；?∈-賴氨酸）鍵使這種早期網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相當(dāng)穩(wěn)定，并通過之前確定的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶3在毛囊基底部的表達(dá)和活化發(fā)揮作用。

該研究發(fā)現(xiàn)，從Ⅰ區(qū)開始到Ⅲ區(qū)的末端（距毛球部800 μm），其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遵循冪次定律呈連續(xù)的機(jī)械硬化。在Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)，小的大纖絲呈橫向聚集，導(dǎo)致其直徑逐漸增大進(jìn)而使IFs形成網(wǎng)絡(luò)。而且還出現(xiàn)大纖絲所占容積率的逐漸增加，同時(shí)伴有AFM觀察到的微觀網(wǎng)絡(luò)的漸進(jìn)性定向和X射線衍射確定的超螺旋角蛋白圈的漸增性極化。總之，這些結(jié)果顯示，要形成成熟毛發(fā)的很大一部分蛋白質(zhì)在Ⅱ區(qū)末端被合成大纖絲，通常受調(diào)于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶為基礎(chǔ)的網(wǎng)絡(luò)，這與從Ⅲ區(qū)向前所表達(dá)的角蛋白類型缺乏進(jìn)一步改變的結(jié)果一致。該研究能夠通過使用一種各向同性半柔性交聯(lián)三維網(wǎng)絡(luò)模型（非仿射纖維彎曲是主要的彈性機(jī)制）從理論上模擬Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)內(nèi)的相關(guān)機(jī)械性硬化。在這種非熱能的網(wǎng)絡(luò)中，網(wǎng)絡(luò)的篩孔尺寸必須小于纖維持續(xù)長(zhǎng)度，后者可以從Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)內(nèi)的大纖絲結(jié)構(gòu)加以推斷。這些非熱能模型通常是纖維組織如膠原，不同于其他用于描述肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)的模型。

大纖絲的直徑在Ⅱ區(qū)后段（500 μm處）達(dá)到最大值，而機(jī)械性硬化仍在持續(xù)增強(qiáng)。因此上述模型不能解釋這種持久性硬化，提示有其他附加的因素使其變硬，如漸增的網(wǎng)絡(luò)向性及密實(shí)性，以及二硫化物交聯(lián)所致大纖絲內(nèi)在的機(jī)械強(qiáng)化。大纖絲的內(nèi)在強(qiáng)化可能由KAPs（尤其是超高含硫家族）的連續(xù)合成所驅(qū)動(dòng)，如同原位雜交研究中所示直至Ⅱ區(qū)后段，提示KAPs不斷的融入大纖絲中。與之相符，X射線衍射實(shí)驗(yàn)顯示了在500～700 μm之后，Ⅲ區(qū)內(nèi)KAP/IF類六邊形網(wǎng)絡(luò)的逐漸出現(xiàn)和IF內(nèi)部結(jié)構(gòu)的最后成熟。DTT還原實(shí)驗(yàn)證實(shí)二硫鍵對(duì)整體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的重要作用在Ⅱ區(qū)內(nèi)已經(jīng)顯現(xiàn)。然而，因?yàn)榇蠖鄶?shù)KAP/IF二硫鍵的構(gòu)成遠(yuǎn)離毛囊（在Ⅳ區(qū)內(nèi)，最早650 μm），所以距離基質(zhì)結(jié)構(gòu)的完成還很遠(yuǎn)。因此，這些早期二硫化物主要代表了IF內(nèi)的二硫化物，其促進(jìn)了大纖絲的整體機(jī)械性能。似乎這種IF內(nèi)二硫化物的形成構(gòu)成了導(dǎo)致毛囊該區(qū)域內(nèi)IF成熟的驅(qū)動(dòng)力。這一結(jié)果與某些研究者的近期工作相符，后者提出Ⅲ區(qū)內(nèi)IFs的成熟應(yīng)該有IF內(nèi)半個(gè)半胱氨酸基團(tuán)相伴，從而能夠完成這種交聯(lián)。

該研究發(fā)現(xiàn)，在IV區(qū)內(nèi)（始于800 μm），毛發(fā)纖維的彈性模量?jī)H為輕度增加（系數(shù)為2）。對(duì)于浸沒于PBS內(nèi)的毛囊來說，機(jī)械性成熟的完成從1 000 μm處至球部上方。這與緊密壓縮的纖維結(jié)構(gòu)共同提示向延伸為主的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。與之相反，Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以彎曲為主。然而，DTT在1 500 μm處對(duì)毛囊機(jī)械力的影響是800 μm處的兩倍，證實(shí)在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的進(jìn)一步變化。X射線微衍射結(jié)果顯示，KAP/IF二硫化物網(wǎng)絡(luò)的形成是發(fā)生在800 μm以上僅有的結(jié)構(gòu)重排。KAP/IF二硫化物網(wǎng)絡(luò)對(duì)毛囊機(jī)械力的這種低影響力，盡管其密度超高，很可能是實(shí)驗(yàn)過程中PBS浸沒的結(jié)果。由于KAP基質(zhì)的吸濕特性使其在水中會(huì)膨脹，而IFs的吸水量極少，從而導(dǎo)致離子與H鍵之間的相互作用減弱。這種膨脹能夠使所測(cè)量的基質(zhì)的機(jī)械作用減至最小。KAP/IF二硫化物網(wǎng)絡(luò)的最后重排與水分的丟失最終確定了毛囊纖維的角化進(jìn)程。

四、結(jié)論

該研究在組織水平上將角蛋白大纖絲結(jié)構(gòu)和分子結(jié)構(gòu)的變化與局部機(jī)械性能聯(lián)系在一起。復(fù)雜的同步變化（包括大纖絲增厚、纖維定向排列和角質(zhì)化進(jìn)程）導(dǎo)致毛發(fā)纖維的硬度在短短1 mm內(nèi)增加了3個(gè)數(shù)量級(jí)。該研究結(jié)果與現(xiàn)存的關(guān)于毛囊結(jié)構(gòu)和生物學(xué)的文獻(xiàn)完全相符，同時(shí)與相關(guān)結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能的理論模型兼容。該研究還進(jìn)一步證實(shí)了一種異構(gòu)肽網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)可使早期角蛋白大纖絲穩(wěn)定的假設(shè)，并提出此后的一系列二硫化物網(wǎng)絡(luò)形成事件。

［陳旭孔佩慧摘自Bornschloql T,Bildstein L,Thibaut S,et al.Keratin network modifications lead to the mechanical stiffening of the hair follicle fiber［J］.Proc Natl Acad Sci USA,2016,113（21）:5940?5945.DOI:10.1073/pnas.1520302113.］