王英 鄧永強(qiáng) 張代 芬邢坤 （四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 610041）

PCR反應(yīng)常見問題及對(duì)策分析

王英 鄧永強(qiáng) 張代 芬邢坤 （四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 610041）

PCR是快速擴(kuò)增DNA的一種方式，可檢測(cè)到劑量非常低的DNA分子，常用于動(dòng)物疫病病原的快速檢測(cè)。文中對(duì)PCR反應(yīng)中常見問題及原因逐一分析，以提高PCR反應(yīng)的準(zhǔn)確性，科學(xué)指導(dǎo)動(dòng)物疫病診斷。

PCR；常見問題；對(duì)策

PCR全稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （Polymerase Chain Reaction）， 1983 年美國Mullis首先提出設(shè)想，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)，即簡(jiǎn)易DNA擴(kuò)增法[1]。PCR是體外快速擴(kuò)增DNA的一種方式，主要在高溫下變性、低溫退火、適合溫度下延伸等步驟循環(huán)進(jìn)行，使DNA迅速擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便，可快速體外檢測(cè)微量DNA，是各級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)和診斷的常用技術(shù)，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性直接關(guān)系動(dòng)物疫病的診斷和診治效果?，F(xiàn)將PCR反應(yīng)中常見的問題及原因匯總分析如下，以提高PCR在臨床診斷中準(zhǔn)確性，科學(xué)指導(dǎo)動(dòng)物疫病診斷。

1 假陽性

1.1 引物不合適

靶序列太短或引物太短易出現(xiàn)假陽性。引物特異性不強(qiáng)，即能擴(kuò)增出目的序列，也能擴(kuò)增出非目的性序列，導(dǎo)致假陽性。需要重新設(shè)計(jì)特異性強(qiáng)的引物。

1.2 氣溶膠污染

空氣與液體面摩擦，操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋或吸樣時(shí)移液槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而導(dǎo)致污染。操作時(shí)要輕柔，避免氣溶膠的產(chǎn)生。

1.3 儀器污染

離心管密封不嚴(yán)導(dǎo)致反應(yīng)液在操作過程中附著在離心機(jī)、PCR反應(yīng)儀等儀器上，或由于移液槍使用不當(dāng)，樣本吸附在移液槍內(nèi)壁導(dǎo)致交叉污染。定期清理離心機(jī)、PCR反應(yīng)儀，減少交叉污染。移液槍應(yīng)專用，如只用于加樣或提取DNA等。

1.4 操作不規(guī)范

由于操作不當(dāng)，陽性對(duì)照DNA混入檢測(cè)樣本中從而出現(xiàn)假陽性擴(kuò)增。操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止陽性對(duì)照DNA吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。加樣時(shí)應(yīng)先加陰性對(duì)照樣品，再加待檢樣品，最后再加陽性對(duì)照樣品。

1.5 器材污染

PCR反應(yīng)應(yīng)用的所有器材包括槍頭、離心管等均應(yīng)高壓消毒，離心管和槍頭等應(yīng)一次性使用。吸取不同樣本時(shí)要及時(shí)更換槍頭，必要時(shí)，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射以破壞存在的核酸。實(shí)驗(yàn)操作要考慮分區(qū)試驗(yàn)，如設(shè)立DNA提取室、擴(kuò)增室等。

2 假陰性

2.1 DNA模板純度不佳

在提取模板的過程中，操作不當(dāng)導(dǎo)致模板丟失過多、雜蛋白質(zhì)高，或制備的模板中含有PCR反應(yīng)抑制劑[2]都會(huì)影響PCR的擴(kuò)增效率。重新提取DNA模板。

2.2 變性不完全

變性溫度低或時(shí)長(zhǎng)不足導(dǎo)致模板DNA變性不徹底，最終擴(kuò)增失敗。提高變性溫度，延長(zhǎng)變性反應(yīng)時(shí)間。

3 反應(yīng)條帶弱

3.1 DNA模板量太少

組織樣本中DNA含量低，所以提取出的DNA濃度低，導(dǎo)致反應(yīng)條帶弱。增加DNA模板量，確保DNA模板干凈。

3.2 引物量不足

引物過少導(dǎo)致PCR反應(yīng)效率低。在PCR反應(yīng)中，引物濃度一般為0.1～0.5umol/L[3]。增加引物量。

3.3 變性時(shí)間過長(zhǎng)

變性時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致DNA聚合酶失活。注意減少變性時(shí)間。

3.4 退火溫度過高

退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。以2℃為梯度設(shè)計(jì)梯度優(yōu)化退火溫度。

3.5 延伸時(shí)間太短

堿基沒有充分的時(shí)間進(jìn)行配對(duì)延伸導(dǎo)致擴(kuò)增效率低。以5s為梯度優(yōu)化延伸時(shí)間。

3.6 PCR循環(huán)數(shù)不足

適當(dāng)增加循環(huán)次數(shù)，提升PCR擴(kuò)增效率。

4 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶

4.1 DNA模板量過多

稀釋模板后重新進(jìn)行PCR反應(yīng)。

4.2 引物特異性不強(qiáng)或濃度偏高

引物與靶序列不完全互補(bǔ)或聚合形成二聚體導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增過多，濃度偏高則會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增[1]。重新設(shè)計(jì)特異性強(qiáng)的引物，同時(shí)降低引物濃度。

4.3 Tap聚合酶量過多

減少DNA聚合酶的使用量。

4.4 Mg2+離子濃度過高

M早2+濃度過高可降低PCR反應(yīng)的特異性。注意降低M早2+濃度。

4.5 dNTP濃度過高

減少dNTP的使用量。

4.6 退火溫度過低

提高退火溫度可減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。以2℃為梯度優(yōu)化退火溫度。

4.7 PCR循環(huán)次數(shù)過多

減少反應(yīng)循環(huán)數(shù)。

5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物拖尾

5.1 模板純度不佳

提取的模板中雜蛋白含量高而導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物有拖尾現(xiàn)象。重新制備純度高的DNA模板，嚴(yán)格操作，減少模板中雜蛋白含量。

5.2 緩沖液不合適

緩沖液的加入有助于酶的穩(wěn)定。更換緩沖液。

6 條帶大小與理論值不符

6.1 模板或引物使用錯(cuò)誤

重新配制反應(yīng)體系，確保加入正確的模板和引物。

6.2 污染

環(huán)境污染、氣溶膠污染和儀器污染都會(huì)影響PCR反應(yīng)的特異性。使用全新的試劑和槍頭，對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行徹底清潔后重新進(jìn)行PCR反應(yīng)。

7 陽性對(duì)照無條帶

7.1 DNA模板量太少

增加DNA模板量，并確保DNA模板干凈。

7.2 延伸溫度過高

不利于引物和模板的結(jié)合。以2℃為梯度優(yōu)化延伸溫度。

7.3 變性溫度與時(shí)間

變性溫度低，樣本DNA解鏈不完全導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。提高變性溫度和反應(yīng)時(shí)間。

7.4 退火溫度不合適

以2℃為梯度優(yōu)化退火溫度。

7.5 延伸時(shí)間過短

延伸反應(yīng)的時(shí)間可根據(jù)擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般1kb以內(nèi)延伸1min[1]。以5s為梯度優(yōu)化延伸時(shí)間。

8 陰性對(duì)照出現(xiàn)條帶

8.1 儀器污染

PCR反應(yīng)儀、工作臺(tái)、試劑和槍頭有污染。使用全新的試劑，槍頭要高壓滅菌，對(duì)反應(yīng)儀器和工作臺(tái)進(jìn)行徹底清潔。

8.2 氣溶膠污染

空氣中的氣溶膠進(jìn)入反應(yīng)管導(dǎo)致陰性對(duì)照出現(xiàn)條帶。

9 檢測(cè)重復(fù)性不佳

9.1 加樣不準(zhǔn)確

加入的試劑或模板量不均一導(dǎo)致PCR反應(yīng)結(jié)果不一致。

9.2 儀器硬件因素

更換了反應(yīng)管或PCR反應(yīng)儀導(dǎo)致PCR反應(yīng)結(jié)果不一致。

[1]魏群.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo).北京:高等教育出版社;海德堡:施普林格出版社,1999.12.

[2]現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].高等教育出版社,1993.

[3]PCR檢驗(yàn)技術(shù)[M].四川大學(xué)出版社,1995.

文中有些資料摘自Internet網(wǎng)站，資料中未列出作者，在此向作者表示感謝！

王英，女，黑龍江省雞西市人，碩士，獸醫(yī)師，現(xiàn)從事動(dòng)物疫病防控工作。