李游山，　張婷婷，　朱　瑞

(1.陜西理工學(xué)院 維生素D生理與應(yīng)用研究所， 陜西 漢中 723000；

2.陜西理工學(xué)院 管理學(xué)院， 陜西 漢中 723000)

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牛蛙與斑馬魚中維生素D受體的免疫印跡體系的建立

李游山1，張婷婷1，朱瑞2

(1.陜西理工學(xué)院 維生素D生理與應(yīng)用研究所， 陜西 漢中 723000；

2.陜西理工學(xué)院 管理學(xué)院， 陜西 漢中 723000)

[摘要]選用牛蛙與斑馬魚作為兩棲類和魚類的代表，以牛蛙十二指腸、牛蛙腎、斑馬魚腸作為VDR檢測(cè)的潛在組織器官，通過對(duì)選擇的組織進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)了VDR的組織分布，并在實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為兩棲類、魚類中的VDR研究提供技術(shù)支撐并推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域的研究。

[關(guān)鍵詞]牛蛙；斑馬魚；維生素D受體；免疫印跡

維生素D3是復(fù)雜的固醇類衍生物，動(dòng)物體內(nèi)的維生素D3必須經(jīng)過兩步羥基化，轉(zhuǎn)化成其活性形式1α,25(OH)2D3才能發(fā)揮其最佳生物活性[1]。1α,25(OH)2D3與核內(nèi)的維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)結(jié)合，并招募多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，形成轉(zhuǎn)錄機(jī)器，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而發(fā)揮生物學(xué)作用[2]。VDR在維持機(jī)體鈣、磷代謝平衡，調(diào)節(jié)骨的形成、機(jī)體免疫活性、細(xì)胞增殖和分化等方面起重要作用[3]。

VDR最早發(fā)現(xiàn)于雞的腸中[4]，但VDR的分布并不只是局限于禽類的腸道當(dāng)中。研究表明，VDR廣泛分布于鳥類(雞)[5]、哺乳類(人、小鼠、大鼠等)[6-8]和魚類(斑馬魚、海七鰓鰻、大西洋鮭等)[9-11]的各種組織細(xì)胞中。在過去的30年內(nèi)，至少從50種靶組織或細(xì)胞中鑒定出VDR的存在[12-13]。除了傳統(tǒng)的靶器官腸道[14]、腎臟[15]、骨骼[16]外，VDR還存在于血液淋巴系統(tǒng)(如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等)[17-20]、泌尿生殖系統(tǒng)(如子宮、卵巢和前列腺等)[21]、內(nèi)分泌系統(tǒng)(如甲狀旁腺、腦垂體和胰腺等)[22]以及神經(jīng)系統(tǒng)[23]等。

組織和細(xì)胞中是否存在VDR決定著其能否對(duì)維生素D反應(yīng)，VDR含量多少?zèng)Q定其對(duì)維生素D反應(yīng)強(qiáng)弱或者靈敏性高低。因此，探究VDR在組織和細(xì)胞的分布情況，有助于深入理解維生素D內(nèi)分泌系統(tǒng)的生理功能。目前，維生素受體的研究主要集中于哺乳類和鳥類中，對(duì)高等脊椎動(dòng)物中的VDR研究越來越多，但是在較低等脊椎動(dòng)物(例如兩棲類和魚類)中的VDR作用機(jī)理尚不清楚，需要進(jìn)一步探索。而要在低等脊椎動(dòng)物開展VDR的研究，首要任務(wù)就是要建立維生素D受體的免疫印跡體系作為技術(shù)支撐。本研究選用牛蛙(Ranacatesbeiana)與斑馬魚(Daniorerio)作為兩棲類和魚類的代表，以期建立針對(duì)低等脊椎動(dòng)物VDR的免疫印跡體系。

1材料和方法

1.1供試材料和試劑耗材

C57BL/6小鼠購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，成年牛蛙與斑馬魚購自漢中市水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)。取成年小鼠(2月齡)十二指腸、小鼠腎、牛蛙十二指腸、牛蛙腎和斑馬魚腸等組織樣品液氮速凍后于-80 ℃保存。蛋白酶抑制劑cocktail購自Sigma公司；BSA購自Genview公司；羅氏ECL超強(qiáng)顯色試劑盒購自Thermo Scientlfic公司；小鼠抗人VDR單克隆抗體D-6和兔抗大鼠VDR多克隆抗體C-20購自Santa Cruz Biotechnology公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(L)購自Jackson Immuno Research Laboratories公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、NC膜和脫脂奶粉購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2蛋白質(zhì)的提取

蛋白質(zhì)提取參照先前已報(bào)道的方法，并略作調(diào)整[24]。將采集的組織清洗后切成小塊，迅速置于組織裂解液(20 mM HEPES，1 mM EDTA，4% SDS，0.01 mg/mL蛋白酶抑制劑cocktail，pH 7.4)中煮沸10 min。充分超聲破碎組織樣品，并煮沸5 min。在室溫12 000 g離心15 min后，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，棄去含有少量或無VDR的沉淀部分。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)BCA法定量、12%的SDS-PAGE分離后，考馬斯亮藍(lán)染色觀察。

1.3抗體的選擇

50 μg蛋白樣品經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，采用濕轉(zhuǎn)法(恒流200 mA，42 min)，印記至NC膜上。加入6% BSA，室溫孵育2 h。用TBST(20 mM Tris-HCl，0.88% NaCl，0.05% Tween 20，pH 7.6)清洗3次，每次5 min。加入TBST稀釋的一抗(小鼠抗人VDR單克隆抗體D-6，0.2 μg/mL；或兔抗大鼠VDR多克隆抗體C-20，0.4 μg/mL)，4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜5次，每次5 min。加入VDR一抗對(duì)應(yīng)的二抗(HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(L)，1∶10 000；或HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，1∶10 000)，45 rpm，37 ℃孵育1.5 h。用TBST洗膜5次，每次5 min。最后，利用羅氏ECL超強(qiáng)顯色試劑盒顯色5 min，壓片曝光(曝光時(shí)間根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱而有所調(diào)整)、顯影、定影、觀察。對(duì)照組以等體積TBST溶液替代一抗，加入等量的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(L)作為二抗，其余條件同實(shí)驗(yàn)組。

1.4不同封閉條件對(duì)VDR檢測(cè)的影響

分別采用5%脫脂奶粉和6% BSA作為封閉液，其余條件同1.3。

1.5VDR免疫印跡條件的優(yōu)化

優(yōu)化后的VDR免疫印跡體系采用6% BSA作為封閉液，D-6作為一抗(抗體濃度為1 μg/mL)，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(L)作為二抗(1∶10 000稀釋)，其余條件同1.3。該實(shí)驗(yàn)體系可用于建立牛蛙和斑馬魚中VDR的免疫印跡體系。

2結(jié)果與分析

2.1蛋白質(zhì)樣品的SDS-PAGE電泳分離

圖1　蛋白質(zhì)樣品的還原型SDS-PAGE電泳分析

十二指腸和腎是VDR高表達(dá)的組織，也是維生素D的主要靶組織，在維持機(jī)體鈣、磷平衡中發(fā)揮著重要作用。因此，實(shí)驗(yàn)選取牛蛙十二指腸、牛蛙腎、斑馬魚腸作為VDR檢測(cè)的潛在組織器官，建立針對(duì)牛蛙與斑馬魚VDR的免疫印跡體系。VDR本質(zhì)上是一種配體依賴的順式激活轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，主要定位于細(xì)胞核內(nèi)。為了有效提取核內(nèi)VDR蛋白，參照先前已報(bào)道的方法[24]，略作調(diào)整后，提取組織蛋白質(zhì)。利用12%的還原型SDS-PAGE對(duì)提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離檢測(cè)。如圖1所示，其中Marker為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，m-Duodenum表示小鼠十二指腸，b-Duodenum和b-Kidney分別表示牛蛙十二指腸和牛蛙腎，z-Intestine表示斑馬魚腸。結(jié)果顯示蛋白質(zhì)提取效果良好，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2抗體的選擇

要在低等脊椎動(dòng)物中建立VDR的免疫印跡體系，必須選擇一種能夠與其VDR高效、特異反應(yīng)的抗體。目前，有十幾種市售VDR抗體，其中應(yīng)用最廣泛的是大鼠單克隆抗體9A7、兔多克隆抗體C-20、小鼠單克隆抗體IVG8C11、小鼠單克隆抗體D-6。前人的研究結(jié)果表明，VDR抗體D-6和C-20具有很高的靈敏性和多功能性，能夠和人、大鼠、小鼠、猴、豬、雞的VDR抗原反應(yīng)[24]。因此，本研究選擇D-6和C-20作為建立低等動(dòng)物VDR的免疫印跡體系的候選抗體。為了進(jìn)一步比較以上兩種VDR抗體的特異性和靈敏性，實(shí)驗(yàn)選取已知能夠響應(yīng)維生素D反應(yīng)的組織——小鼠十二指腸，進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

由于小鼠內(nèi)源性IgG重鏈的免疫印跡條帶與VDR條帶位置一致，為了避免IgG重鏈對(duì)免疫印跡的潛在干擾，實(shí)驗(yàn)選用了一種只識(shí)別IgG輕鏈的特殊二抗(HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(L))。如圖2所示，m-Duodenum和m-Kidney分別表示小鼠十二指腸和小鼠腎，VDR和Endo-IgG(L)分別表示小鼠VDR和內(nèi)源性IgG輕鏈，Ns band表示非特異性信號(hào)條帶。HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(L)除了與小鼠內(nèi)源性IgG輕鏈反應(yīng)，還非特異性的識(shí)別幾種未知蛋白，但不與內(nèi)源性IgG重鏈反應(yīng)(圖2(b))，與預(yù)期結(jié)果基本一致。與對(duì)照組相比，D-6為一抗的免疫印跡體系中，能夠檢測(cè)到明顯的VDR信號(hào)條帶(圖2(a))。以C-20作為一抗的免疫印跡體系中，只檢測(cè)到微弱的VDR信號(hào)條帶，而且在VDR上下都出現(xiàn)了多個(gè)較強(qiáng)的非特異蛋白條帶(圖2(c))。以上結(jié)果表明，在當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)條件下，D-6的特異性和靈敏性都要優(yōu)于C-20抗體。因此，選取D-6抗體作為一抗進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(a)以D-6作為一抗　　　　　　　　(b)以TBST替代一抗　　　　　　(c)以C-20作為一抗　　圖2　采用不同一抗的VDR免疫印跡

2.3不同封閉條件對(duì)VDR檢測(cè)的影響

為了進(jìn)一步優(yōu)化VDR檢測(cè)的封閉條件，實(shí)驗(yàn)選擇了兩種較為常用且效果較好的封閉液(5%脫脂奶粉或6%BSA)應(yīng)用于VDR的免疫印跡體系中，如圖3所示。結(jié)果表明，以5%脫脂奶粉或6%BSA作為封閉液的免疫印跡體系都能檢測(cè)到較強(qiáng)的VDR的信號(hào)條帶。相較于5%脫脂奶粉組，6%BSA組的VDR條帶信號(hào)更強(qiáng)、特異性更高。因此，選用6%BSA作為封閉液應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(a)以5%脫脂奶粉作為封閉液的VDR免疫印跡　　　(b)以6%BSA作為封閉液的VDR免疫印跡圖3　不同封閉條件對(duì)VDR檢測(cè)的影響

2.4VDR免疫印跡條件的優(yōu)化

基于上述實(shí)驗(yàn)，對(duì)免疫印跡體系進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，以期提高VDR檢測(cè)的特異性和靈敏性。優(yōu)化后的免疫印跡體系采用6% BSA作為封閉液，D-6作為一抗(抗體濃度為1 μg/mL)，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(L)作為二抗(1∶10 000稀釋)，其余條件同1.3。如圖4所示，其中“D-6”和“Control”分別表示以D-6作為一抗或等體積的TBST溶液替代一抗的VDR免疫印跡；與對(duì)照組(Control)相比，實(shí)驗(yàn)組(D-6)出現(xiàn)信號(hào)較強(qiáng)、特異性較高的VDR條帶。該免疫印跡體系將用于牛蛙和斑馬魚VDR的蛋白檢測(cè)。

2.5牛蛙與斑馬魚中VDR的免疫印跡體系建立

為了在牛蛙與斑馬魚中建立VDR的免疫印跡體系，實(shí)驗(yàn)選取牛蛙十二指腸、牛蛙腎、斑馬魚腸作為VDR檢測(cè)的潛在靶組織、器官，以小鼠十二指腸作為陽性對(duì)照，進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)(圖5)。圖5中mVDR、bVDR和zVDR分別表示小鼠VDR、牛蛙VDR和斑馬魚VDR。D-6抗體能夠和小鼠、牛蛙、斑馬魚的VDR反應(yīng)。在牛蛙十二指腸和腎中特異地檢測(cè)到兩種形式的VDR條帶，上面的條帶信號(hào)較強(qiáng)(VDR亞型I)，下面的條帶信號(hào)較弱(VDR亞型II)，它們的表觀分子量分別約為60 kDa和55 kDa。在斑馬魚的腸中也檢測(cè)到兩條信號(hào)帶，其中表觀分子量約為56 kDa的條帶對(duì)應(yīng)于VDR蛋白，約為30 kDa的條帶推測(cè)為非特異性信號(hào)帶。牛蛙、斑馬魚、小鼠VDR的大小略有差異，其中斑馬魚VDR大于小鼠VDR，略大于牛蛙VDR亞型II，但小于牛蛙VDR亞型I。以上結(jié)果表明，牛蛙十二指腸、牛蛙腎、斑馬魚腸中存在VDR，本研究建立的免疫印跡體系能夠成功應(yīng)用于牛蛙和斑馬魚VDR的蛋白質(zhì)檢測(cè)。

圖4　小鼠VDR檢測(cè)條件的優(yōu)化　　　圖5　牛蛙與斑馬魚中VDR的免疫印跡體系建立

3討論

VDR廣泛分布于各種組織細(xì)胞中，幾乎所有細(xì)胞都能夠和維生素D響應(yīng)；大約3%的人類或小鼠基因組是受維生素D內(nèi)分泌系統(tǒng)直接或間接調(diào)控的，這表明維生素D具有除調(diào)節(jié)鈣磷平衡之外更為廣泛的功能[25]。維生素D是通過與VDR結(jié)合來發(fā)揮其生理功能，因此測(cè)定組織細(xì)胞中的VDR水平至關(guān)重要。近年來，國內(nèi)外對(duì)哺乳動(dòng)物和鳥類VDR的研究越來越多，但對(duì)兩棲類和魚類等較低等脊椎動(dòng)物中的VDR功能知之甚少，有必要進(jìn)行深入研究。要在這些低等脊椎動(dòng)物中開展VDR的研究，首先要建立一套高效的VDR免疫印跡體系作為技術(shù)支撐。本研究選用牛蛙(Ranacatesbeiana)與斑馬魚(Daniorerio)作為兩棲類和魚類的代表，在這兩個(gè)物種中成功建立了一套VDR免疫印跡體系。

兩棲動(dòng)物在動(dòng)物進(jìn)化中占據(jù)著舉足輕重的地位，是第一個(gè)從水生向陸生過渡的動(dòng)物，代表著脊椎動(dòng)物發(fā)育的原始模式。水生到陸生環(huán)境的改變，伴隨著新器官的形成和原有器官機(jī)能的轉(zhuǎn)變。水生動(dòng)物(魚和蝌蚪)是通過鰓和皮膚從溶有礦物離子的水中獲取鈣，而陸生動(dòng)物從食物中攝取鈣，兩棲動(dòng)物從水生向陸生的轉(zhuǎn)變會(huì)增加對(duì)膳食鈣的依賴[26]。為了從進(jìn)化的角度更好的理解維生素D內(nèi)分泌系統(tǒng)在兩棲動(dòng)物中的功能，有必要對(duì)其VDR的分布和功能進(jìn)行研究。研究者從非洲爪蟾(Xenopuslaevis)腸道總RNA中克隆出VDR的cDNA，并在成年爪蟾的腎、腸、皮膚、骨等組織中檢測(cè)到VDR mRNA[27]。本研究利用免疫印跡技術(shù)在牛蛙組織中檢測(cè)到VDR蛋白，這在兩棲類中尚屬首次。有研究顯示非洲爪蟾中存在兩種VDR mRNA，其大小分別為2.2 kb和1.8 kb[27]。本研究在牛蛙十二指腸和腎中檢測(cè)兩種形式的VDR蛋白條帶，其表觀分子量分別約為60 kDa和55 kDa大小。

斑馬魚具有完善的基因組數(shù)據(jù)庫和嗎啉代基因敲低的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，是研究離子調(diào)控和相關(guān)內(nèi)分泌控制的較好動(dòng)物模型。前人研究表明，斑馬魚中存在兩種的VDR亞型，即VDRa和VDRb，且維生素D-VDRa信號(hào)通路能夠通過上調(diào)上皮鈣通道基因(EcaC)來刺激斑馬魚的鈣吸收[9,28]。目前，Real time-PCR和免疫組織化學(xué)技術(shù)是檢測(cè)斑馬魚VDR的主要技術(shù)手段[9,29]，尚缺乏高效特異的免疫印跡體系對(duì)VDR蛋白進(jìn)行分析。盡管基于VDRa 和VDRb的多克隆抗體和NBT(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/nitro-blue tetrazolium)顯色液的免疫印跡體系已被嘗試用于斑馬魚中VDR的檢測(cè)，但該方法的特異性和靈敏性都有待提高[9]。本研究中基于小鼠D-6抗體和ECL超強(qiáng)顯色試劑盒建立的免疫印跡體系，一定程度上提高了VDR檢測(cè)的靈敏性。

牛蛙腎、牛蛙十二指腸、斑馬魚腸中檢測(cè)到VDR蛋白，暗示維生素D內(nèi)分泌系統(tǒng)可能在低等脊椎動(dòng)物的腸和腎中發(fā)揮重要作用。牛蛙與斑馬魚中VDR的免疫印跡體系的建立將為兩棲類、魚類中VDR研究提供技術(shù)支撐，推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域的研究。

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[責(zé)任編輯：李 莉]

Establishment of immunoblotting system for vitamin D receptors

in bullfrog and zebrafish

LI You-shan1, ZHANG Ting-ting1,ZHU Rui2

(1.Vitamin D Research Institute, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China;

2.School of Management, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China)

Abstract:To date, vitamin D receptors (VDRs) from mammalian and avian have been studied extensively, but little is known about VDR in lower vertebrate species such as amphibians and fishes. In this study, bullfrog and zebrafish were chosen as the representatives of amphibians and fishes, the bullfrog duodenum, bullfrog kidney and zebrafish intestine were collected as potential target tissues for VDR detection. After protein extraction from the selected tissues, the tissue distribution of VDR was detected by immunoblotting, and the experimental conditions were optimized in the experiment. This study will provide the valuable technical support for VDR studies of amphibians and fishes, and promote advances in research of the related fields.

Key words:bullfrog;zebrafish;vitamin D receptor;immunoblotting

作者簡(jiǎn)介：李游山(1985—)，男，河北省隆堯縣人，陜西理工學(xué)院講師，博士，主要研究方向?yàn)榫S生素D及其受體的功能。

基金項(xiàng)目：漢中市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013hzzx-32);陜西理工學(xué)院科研基金資助項(xiàng)目(SLGQD13(2)-23)

收稿日期：2015-07-06

[中圖分類號(hào)]Q565

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-2944(2015)06-0039-07