汪玉琪來岳標(biāo)姚慶華

姜黃素對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)的A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

汪玉琪1來岳標(biāo)1姚慶華2

目的研究姜黃素對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）誘導(dǎo)的肺腺癌A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）作用及可能機(jī)制。方法選取體外培養(yǎng)肺腺癌A549細(xì)胞采用MTT法檢測姜黃素細(xì)胞抑制率。實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組、TGF-β組（TGF-β 5ng/mL）、TGF-β+姜黃素組（TGF-β 5ng/mL+姜黃素10μmol/L）、姜黃素組（姜黃素10μmol/L）。采用Transwell細(xì)胞遷移及浸潤實(shí)驗(yàn)檢測各組的運(yùn)動(dòng)遷移和侵襲浸潤的能力，免疫熒光和Western印跡法實(shí)驗(yàn)檢測各組EMT相關(guān)標(biāo)記物E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)水平與Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)P-GSK3β、GSK3β、β-catenin、c-Myc蛋白以及Snail蛋白表達(dá)水平，同時(shí)檢測Wnt/β-catenin抑制劑XAV939（1、2、4μmol/L）作用后EMT表達(dá)情況。結(jié)果MTT實(shí)驗(yàn)表明，10μmol/L姜黃素作用A549細(xì)胞24h和48h時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率分別為（12.21±2.60）%和（21.33±3.25）%（P＜0.05）；TGF-β能顯著促進(jìn)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移和侵襲浸潤，下調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)，上調(diào)波形蛋白及N-鈣黏蛋白的表達(dá)，伴有P-GSK3β、β-catenin和c-Myc的表達(dá)增加以及Snail蛋白表達(dá)增加，GSK3β表達(dá)無明顯變化，而姜黃素可以抑制TGF-β的作用（P＜0.05）。同時(shí)，XAV939對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的EMT也有抑制作用。結(jié)論姜黃素可能通過抑制Wnt/βcatenin信號(hào)通路來抑制TGF-β誘導(dǎo)的A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

肺腺癌A549細(xì)胞；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；姜黃素；Wnt/β-catenin信號(hào)通路

KEY WORDSA549 lung adenocarcinoma cells;epithelial-mesenchymal transition;curcumin;Wnt/β-cateninsignaling pathway

姜黃素已被證明具有抑制致癌物活化，調(diào)節(jié)細(xì)胞生存和凋亡，抑制血管生成和抗侵襲、抗轉(zhuǎn)移作用[1-2]。目前已知姜黃素通過抑制Wnt信號(hào)通路的激活來抑制癌細(xì)胞的侵襲[3]。研究[4-6]報(bào)道，姜黃素通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（matnix metalloproteinase，MMP）-2、MMP-9和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）來抑制A549肺癌細(xì)胞的侵襲遷移。而姜黃素在肺癌細(xì)胞中的抗侵襲轉(zhuǎn)移作用是否與其抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用有關(guān)目前尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過體外研究，探討姜黃素對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌細(xì)胞株A-549由浙江省胃腸重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。細(xì)胞在37℃、5%CO2含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥 物 姜黃素，Sigma公司。

1.3 試劑及儀器 TGF-β細(xì)胞因子購自PeproTech公司。抗體包括 P-GSK3β、GSK3β、β-catenin、cmyc、Snail、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白和β-actin及Wnt/β-catenin的抑制劑XAV939均為Sigma公司。6.5mm8μ孔徑的聚碳酸酯膜Transwell試劑盒購自美國康寧，細(xì)胞侵襲浸潤試劑盒購自Millipore。本研究所需的儀器設(shè)備由浙江省胃腸重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 方 法

1.4.1 MTT實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞調(diào)整濃度至4×104/mL，200μL/孔加入96孔板中。當(dāng)貼壁細(xì)胞后，姜黃素（5～80μmol/L）加入到96孔板中進(jìn)一步培養(yǎng)，每個(gè)藥物濃度建立五個(gè)平行孔，培養(yǎng)12h、24h和48h后，每孔加MTT溶液（5mg/mL）20μL。繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150μL DMSO，振蕩10min。選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，計(jì)算不同濃度姜黃素對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制率，以姜黃素濃度為橫坐標(biāo)，增殖抑制率為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.2 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組、TGF-β組（TGF-β 5ng/mL）、姜黃素組（姜黃素10μmol/L）、TGF-β+姜黃素組（TGF-β 5ng/mL+姜黃素10μmol/L）；在姜黃素和/或TGF-β誘導(dǎo)A549細(xì)胞72h后，各組細(xì)胞均用PBS洗兩遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至10×105/mL。取細(xì)胞懸液200μL加入Transwell上層小室，下層小室加入600μL含10%FBS的培養(yǎng)基，37℃5%CO2培養(yǎng)24h。用棉簽輕輕擦去聚碳酯膜上表面的細(xì)胞。用4%多聚甲醛室溫下固定 15min，0.1%結(jié)晶紫染色30min。附著于聚碳酯膜下表面的細(xì)胞在高倍鏡下（× 200）隨機(jī)取6個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均數(shù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.4.3 細(xì)胞浸潤實(shí)驗(yàn) 將濃度為0.5g/L人工基質(zhì)膠20mL鋪于Transwell侵襲小室聚碳酯微孔膜（孔徑8mm）的上表面，置37℃30min使其聚成凝膠。實(shí)驗(yàn)分成四組：空白對(duì)照組、TGF-β組（TGF-β 5ng/mL）、TGF-β+姜黃素組（TGF-β 5ng/mL+姜黃素10μmol/L）、姜黃素組（姜黃素10μmol/L）；Transwell上室中分別加入已消化重懸的各組用姜黃素和/或TGF-β預(yù)處理的細(xì)胞200μL（1×108/L），下室中加入600μL含10%FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后取出，PBS清洗，棉簽去除濾膜上層細(xì)胞，將已經(jīng)侵入并貼附于微孔膜下層的細(xì)胞固定并結(jié)晶紫染色，高倍鏡下（×200）直接觀察穿過膜的細(xì)胞數(shù)。隨機(jī)計(jì)數(shù)6個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)穿過8mm微孔的細(xì)胞數(shù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.4.4 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞，將A549細(xì)胞分別接種于載玻片上，分成空白對(duì)照組、TGF-β組（TGF-β5ng/mL）、TGF-β+姜黃素組（TGF-β5ng/mL+姜黃素10μmol/L）、姜黃素組（姜黃素10μmol/L）；用TGF-β和/或姜黃素處理72h后進(jìn)行免疫熒光分析。細(xì)胞處理72h后，用4%多聚甲醛固定15min，用PBS洗滌3次，并用0.1%的曲拉通穿孔15min。細(xì)胞用5%血清白蛋白孵育1h，阻斷非特異性蛋白。加入一抗（E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白抗體），4℃孵育過夜。用PBS沖洗3次后用有熒光素酶標(biāo)記的羊抗兔的熒光二抗在37℃的恒溫箱中孵育1h。染色的細(xì)胞被放置于載玻片上，使用OLS3100熒光顯微鏡進(jìn)行觀察（×400）。

1.4.5 免疫蛋白質(zhì)印跡分析 取對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞，將A549細(xì)胞分別接種于培養(yǎng)瓶中，分成空白對(duì)照組、TGF-β組（TGF-β 5ng/mL）、TGF-β+姜黃素組（TGF-β5ng/mL+姜黃素10μmol/L）、姜黃素組（姜黃素10μmol/L）；用TGF-β和/或姜黃素處理72h。取10×105個(gè)對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞加入0.5mL預(yù)冷細(xì)胞裂解緩沖液冰上孵育30min。離心收集上清，BCA法測定蛋白含量，100g/LSDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后目的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用含50g/L脫脂牛奶的TBST進(jìn)行封閉1h，加入一抗（E-鈣黏蛋白）（1:1000）、N-鈣黏蛋白（1:1000）、Snai（l1:1000）、波形蛋白（1:1000）、β-actin（1:1000）、P65（1:1000）、P-P65 （1:1000）、IKB（1:1000）4℃孵育過夜，第2天用1∶5000的二抗（Santa Cruz）室溫孵育2h后用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，照相并分析結(jié)果。

1.4.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用（±s） 表示，采用One-wayANOVA檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素抑制肺癌細(xì)胞增殖作用 5～80μmol/L的姜黃素作用12h、24h、48h后，A549細(xì)胞的生長受到不同程度抑制且呈濃度依賴性（圖1，插頁）。當(dāng)10μmol/L姜黃素作用A549細(xì)胞24h和48h時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率分別為（12.21±2.60）%和（21.33±3.25）% （P＜0.05）。根據(jù)結(jié)果，選擇10μmol/L為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的藥物作用濃度。

2.2 姜黃素抑制TGF-β誘導(dǎo)的A549細(xì)胞在體外的運(yùn)動(dòng)遷移和侵襲浸潤 TGF-β組（TGF-β 5ng/mL）24h后侵襲穿膜的細(xì)胞數(shù)明顯高于空白對(duì)照組；姜黃素組（姜黃素10μmol/L）24h后侵襲穿膜的細(xì)胞數(shù)明顯低于TGF-β+姜黃素組（TGF-β5ng/mL+姜黃素10μmol/L）。TGF-β組細(xì)胞表現(xiàn)出比對(duì)照組更加活躍的遷移和侵襲能力（圖2，插頁），TGF-β的誘導(dǎo)能增強(qiáng)A549細(xì)胞的遷移和侵襲，而姜黃素可以抑制TGF-β對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的誘導(dǎo)作用。這些結(jié)果表明，姜黃素能抑制TGF-β誘導(dǎo)的肺腺癌A549細(xì)胞的EMT。

2.3 姜黃素抑制A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）標(biāo)志物的表達(dá) 與對(duì)照組相比，TGF-β處理后的細(xì)胞E-鈣黏蛋白表達(dá)減少，而N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)增加（圖3A～D，插頁）。姜黃素能抑制TGF-β誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT，引起E-鈣黏蛋白的增加而N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)抑制（圖3D，插頁）。

2.4 姜黃素抑制A549細(xì)胞中Snail的表達(dá) TGF-β和/或姜黃素處理A549細(xì)胞72h后，姜黃素對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的肺腺癌A549細(xì)胞中的Snail蛋白的表達(dá)具有抑制作用（圖4，插頁）。

2.5 姜黃素通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制TGF-β誘導(dǎo)的EMT 肺腺癌A549細(xì)胞中P-GSK3β、GSK3β、β-catenin、c-Myc表達(dá)水平的變化可代表Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性變化。研究結(jié)果表明，TGF-β能促P-GSK3β、β-catenin和c-Myc的表達(dá)，而GSK3β表達(dá)無明顯變化，同時(shí)伴有E-鈣黏蛋白的表達(dá)減少，波形蛋白和N-鈣黏蛋白的表達(dá)增加；而姜黃素表現(xiàn)出對(duì)這種現(xiàn)象的一個(gè)抑制作用（圖5A，插頁）。Wnt/β-catenin的抑制劑XAV939（1、2、4 μmol/L）能逆轉(zhuǎn)TGF-β誘導(dǎo)的EMT，伴隨著Snail、N-鈣黏蛋白、波形蛋白表達(dá)降低與E-鈣黏蛋白的表達(dá)增加（圖5B，插頁）。顯示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路在EMT過程中起著重要作用。

3 討論

Snail基因與腫瘤的轉(zhuǎn)移、腫瘤的分級(jí)、腫瘤的復(fù)發(fā)密切相關(guān)，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Snail表達(dá)較高的患者預(yù)后差，生存率下降[7-8]。肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡原因中最常見的原因之一。大多數(shù)肺癌患者被診斷時(shí)已經(jīng)發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[9]。因此，有效的肺癌治療必須包括轉(zhuǎn)移性疾病的治療。EMT被公認(rèn)為是胚胎發(fā)育的基本過程，目前被認(rèn)為是上皮來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程[10-12]。EMT促進(jìn)腫瘤細(xì)胞從起源處轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官的過程是通過一個(gè)特定遺傳程序的激活[13]。因此，使用阻止或逆轉(zhuǎn)這一過程的藥物是一種很有前途的治療策略。而Wnt/β-catenin信號(hào)通路在Snail依賴的EMT中非常重要[14-15]。TGF-β作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白屬于β蛋白超家族，涉及多個(gè)生物過程包括細(xì)胞增殖，凋亡和腫瘤的發(fā)生[16]。TGF-β和Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過Smad蛋白相互聯(lián)系，特別是TGF-β抑制蛋白Smad7，有報(bào)道顯示其通過選擇性下調(diào)游離的βcatenin而上調(diào)與E-鈣黏蛋白連接的β-catenin[17-19]。

姜黃素具有抑制致癌物質(zhì)活化和血管生成、調(diào)節(jié)細(xì)胞生存和凋亡的作用，具有抗侵襲和抗轉(zhuǎn)移的作用[2]。研究[4-6]報(bào)道，姜黃素通過抑制MMP-2、MMP-9和VEGF來抑制A549肺癌細(xì)胞的侵襲遷移。但是這些強(qiáng)大的抗轉(zhuǎn)移效應(yīng)尚未與EMT相聯(lián)系。最重要的是該研究是第一次證明姜黃素能在體外抑制TGF-β誘導(dǎo)的肺腺癌A549細(xì)胞的EMT，將姜黃素的抗腫瘤轉(zhuǎn)移與EMT相聯(lián)系。

本研究利用TGF-β誘導(dǎo)A549細(xì)胞72h為細(xì)胞模型來研究姜黃素對(duì)EMT的抑制作用。通過免疫熒光和免疫蛋白印跡法表明姜黃素能影響TGF-β誘導(dǎo)的EMT標(biāo)志物表達(dá)。Transwell細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移和侵襲浸潤實(shí)驗(yàn)證明姜黃素可抑制腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移和侵襲浸潤。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路是TGF-β誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞EMT中的重要信號(hào)通路。而姜黃素能抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性來抑制EMT。另外E-鈣黏蛋白及波形蛋白這兩個(gè)EMT過程中重要的標(biāo)記物與Snail之間關(guān)系密切[20-21]。許多具有腫瘤預(yù)防作用的物質(zhì)已被證實(shí)通過Snail轉(zhuǎn)錄因子抑制EMT[22]。本研究證實(shí)姜黃素能抑制Snail的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移和浸潤侵襲。

EMT不僅促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的過渡，還可介導(dǎo)細(xì)胞的耐藥性[6]。姜黃素可能會(huì)提高這些藥物的療效。另外，EMT也會(huì)對(duì)放療的敏感性產(chǎn)生影響，包括促進(jìn)放療后的纖維化和放療后的腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)移[23]，而這可能與E-鈣黏蛋白的表達(dá)下調(diào)有關(guān)[24-25]。因此，姜黃素可能通過抑制細(xì)胞的EMT逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞對(duì)化療和放療的不敏感，改善患者預(yù)后。綜上所述，本研究表明姜黃素對(duì)腫瘤侵襲能力的影響與抑制細(xì)胞的EMT過程是相關(guān)的，其通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化來調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)和細(xì)胞的EMT。這個(gè)結(jié)果為姜黃素治療肺癌的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

［1］Basnet P，Skalko-Basnet N.Curcumin：an anti-inflammatory molecμLe from a curry spice on the path to cancer treatment［J］.MolecμLes，2011，16：4567-4598.

［2］Jagtap S，Meganathan K，Wagh V，et al.Hescheler J and Sachinidis A：Chemoprotective mechanism of the natural compounds，epigallocatechin-3-o-gallate，quercetin and curcumin against cancer and cardiovascular diseases［J］. Curr Med Chem，2009，16（12）：1451-1462.

［3］Kim HJ.Curcumin suppresses migration and proliferation of Hep3B hepatocarcinoma cells through inhibition of the Wnt signaling pathway［J］.Mol Med Rep，2013，8（1）：282-286.

［4］Barbera MJ，Puig I.RegμLation of Snail transcription during epithelial to mesenchymal transition of tumor cells［J］. Oncogene，2004，23（44）：7345-7354.

［5］Gottardi CJ.Gumbiner BM Distinct molecμLar forms of beta-catenin are targeted to adhesive or transcriptional complexes［J］.J Cell Biol，2004，167（2）：339-349.

［6］Gupta S，Iljin K，Sara H，et al.FZD4 as a mediator of ERG oncogene-induced Wnt signaling and epithelial-to-mesenchymal transition in human prostate cancer cells［J］. Cancer Res，2010，70（17）：6735-6745.

［7］Zhang HJ，Wang HY，Zhang HT，et al.Transforming growth factor β1 promotes lung adenocarcinoma invasion and metastasis by epithelial to mesenchymal transition［J］.Mol Cell Biochem，2011，355（1）：309-314.

［8］Tran DD，Corsa CA，Biswas H，et al.Temporal and spatial cooperation of Snail1 and Twist1 during epithelial-mesenchymal transition predicts for human breast cancer recurrence［J］.Mol Cancer Res，2011，9（12）：1644-1657.

［9］Cagle PT，Allen TC，Dacic S，et al.Revolution in lung cancer：new challenges for the surgical pathologist［J］.Arch Pathol Lab Med，2011，135（1）：110-116.

［10］Micalizzi DS，F(xiàn)arabaugh SM，F(xiàn)ord HL.Epithelialmesenchymal transition in cancer:parallels between normal development and tumor progression［J］.J Mammary Gland Biol Neoplasia，2010，15（2）：117-134.

［11］Franco DL，Mainez J，Vega S，et al.Snail1 suppresses TGF-beta-induced apoptosis and is sufficient to trigger EMT in hepatocytes［J］.J Cell Sci，2010，123（Pt 20）：3467-3477.

［12］Barbera MJ，Puig I，Dominguez D，et al.Regulation of Snail transcription during epithelial to mesenchymal transition of tumor cells［J］.Oncogene，2004，23（44）：7345-7354.

［13］Mulholland DJ，Kobayashi N，Ruscetti M.Pten loss and RAS/MAPK activation cooperate to promote EMT and metastasis initiated from prostate cancer stem/progenitor cells［J］.Cancer Res，2012，72（7）：1878-1889.

［14］Zhang M，Wang M，Tan X，et al.Smad3 prevents betacatenin degradation and facilitates beta-catenin nuclear translocation in chondrocytes［J］.J Biol Chem，2010，285 （12）：8703-8710.

［15］Su Yeon Lee.Wnt/Snail Signaling RegμLates Cytochrome C Oxidase and Glucose Metabolism［J］.Cancer Research，2012，72（14）：3607-3617.

［16］Massague J.How cells read TGF-beta signals［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2000，1（3）：169-178.

［17］Han G.Smad7-induced beta-catenin degradation alters epidermal appendage development［J］.Dev Cell，2006，11 （3）：301-312.

［18］Tang Y，Liu Z，Zhao L，et al.Smad7 stabilizes beta-catenin binding to E-cadherin complex and promotes cell-cell adhesion［J］.J Biol Chem，2008，283（35）：23956-23963.

［19］DiVito KA，Trabosh VA，Chen YS，et al.Smad7 restricts melanoma invasion by restoring N-cadherin expression and establishing heterotypic cell-cell interactions in vivo［J］.Pigment Cell Melanoma Res，2010，23（6）：795-808.

［20］Wu Y.Snail：More than EMT［J］.Cell Adh Migr，2010，4 （2）：199-203.

［21］Fendrich V，Waldmann J，F(xiàn)eldmann G.Unique expression pattern of the EMT markers Snail，Twist and E-cadherin in benign and malignant parathyroid neoplasia［J］.Eur J Endocrinol，2009，160（4）：695-703.

［22］Shankar S，Nall D，Tang SN.Resveratrol inhibits pancreatic cancer stem cell characteristics in human and KrasG12D transgenic mice by inhibiting pluripotency maintaining factors and epithelial-mesenchymal transition［J］.PLoS One，2011，6（1）：e16530.

［23］Jung JW，Hwang SY，Hwang JS，et al.Ionising radiation induces changes associated with epithelial mesenchymal transdifferentiation and increased cell motility of A549 lung epithelial cells［J］.Eur J Cancer，2007，43（7）：1214-1224.

［24］Zhou YC，Liu JY，Li J，et al.Ionizing radiation promotes migration and invasion of cancer cells through transforming growth factor beta mediated epithelial mesenchymal transition［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2011，81（5）：1530-1537.

［25］Theys J，Jutten B，Habets R，et al.E Cadherin loss associated with EMT promotes radioresistance in human tumor cells［J］.Radiother Oncol，2011，99（3）：392-397.

（收稿：2015-06-30 修回：2015-09-02）

Effect of Curcumin on Epithelial-Mesenchymal Transition Induced by TGF-β in A549 lung adenocarcino－ma cells

niversity,Hangzhou(310053),China;2 Department of Integrated Western Medicine and Chinese Medicine,Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou(310022),China WANG Yuqi1,LAI Yuebiao1,YAO Qinghua2. 1 First Clinical College of Zhejiang Chinese Medical U－

ObjectiveTo investigate the effect of curcumin on transforming growth factor β（TGF-β）-inducedepithelial-mesenchymal Transition（EMT）in A549 lung adenocarcinoma cells and the underlying mechanism.MethodsHuman A549 lung adenocarcinoma cells was used to detect inhibition rate of curcumin by MTT assay.The studywas divided into 4 groups:control group,TGF-β group（treated with TGF-β5ng/mL）,TGF-β+curcumin group （treated with TGF-β 5ng/mL and curcumin 10μmol/L）,curcumingroup（treated with curcumin 10μmol/L）.Transwell and cell invasion assays were used to detect the movement and infiltration ability of each group.Immunofluorescence and Western blot analysis were used to detect the expression level of EMT related markers such as E-cadherin,N-cadherin and vimentin and the expression level of Wnt/β-cateninsignaling pathway-related P-GSK3β, GSK3β,β-catenin and c-Mycand Snail protein.The expression level of EMT effected by Wnt/β-catenin inhibitorXAV939 was also determined.ResultsMTT assay showed that 10μmol/Lcurcumin inhibited the proliferation of A549 cells along with the increase of the treatment time（24h:12.21%±2.60%;48h:21.33%±3.25%;P＜0.05）. TGF-β significantly stimulated cell movement and invasion,reduced the expression of E-cadherin,increased the expression of vimentin and N-cadherin,promoted the expression of P-GSK3β,β-catenin,c-Myc proteins and Snail,but made little changes in total of GSK3β.These effectsof TGF-β on A549 cells werecompletely blocked by curcumin（P＜0.05）.XAV939reversed TGF-β-induced EMT.ConclusionCurcumin inhibited EMT induced by TGF-β in A549 lung adenocarcinoma cells probably through inhibiting the Wnt/β-catenin signaling pathway.

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（杭州 310053）；2浙江省腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科（杭州 310022）

姚慶華，Tel：13588899111；E-mail：danfer1001@163.com