劉容枝 李耀華

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·專論·

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑臨床試驗研究要點解析

劉容枝 李耀華

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑具有提高痰涂片陰性肺結(jié)核的檢出率及肺結(jié)核診斷的特異度的優(yōu)點，并可相對快速地鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群與非結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑在臨床試驗中應(yīng)注意臨床試驗機(jī)構(gòu)、對比試劑、樣本等的選擇，以及樣本前處理方法和核酸提取方法的臨床驗證等問題。作者將主要對該類試劑在臨床試驗中的上述重點問題進(jìn)行闡述。

分枝桿菌，結(jié)核； 核酸類； 臨床試驗； 試劑盒，診斷

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)引起的一種傳染性疾病，是全球的主要傳染性疾病之一。近年來，在結(jié)核病診斷領(lǐng)域最大的突破是MTBC核酸檢測試劑的臨床應(yīng)用。筆者所指的MTBC核酸檢測試劑是指利用分子生物學(xué)方法(常用方法為熒光定量PCR法)以MTBC共有的核酸序列為目標(biāo)序列，對痰樣本中的MTBC核酸進(jìn)行體外定性檢測的試劑，可用于肺結(jié)核的輔助診斷。

迄今為止，國內(nèi)外已有多種MTBC核酸檢測試劑獲準(zhǔn)在中國上市。鑒于我國結(jié)核病防治面臨的嚴(yán)峻形勢，國家在政策、科技及產(chǎn)業(yè)化層面逐漸加大了對結(jié)核病診斷、治療、管理和服務(wù)等方面的投入，因此，正在進(jìn)行注冊申報或者預(yù)期研發(fā)該類試劑的生產(chǎn)企業(yè)日漸增多。為了規(guī)范此類試劑的申報，參考美國食品藥品監(jiān)督管理局的相關(guān)文件和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合審評中對國內(nèi)外企業(yè)有關(guān)該部分資料的理解與總結(jié)，現(xiàn)對此類試劑在臨床試驗中應(yīng)關(guān)注的要點進(jìn)行介紹與解析[1-3]。

一、MTBC核酸檢測試劑的優(yōu)勢

MTBC核酸檢測試劑臨床應(yīng)用的核心價值在于：(1)敏感度大大提高，即使樣本中只有極低拷貝數(shù)的細(xì)菌也能檢出。某些已上市的核酸檢測試劑的敏感度可達(dá)到10個菌/ml(最低檢測限)，而培養(yǎng)法為100個菌/ml，涂片法為1000個菌/ml。因此，核酸檢測試劑可提高痰涂片陰性肺結(jié)核的檢出率，在臨床上可用于涂陰肺結(jié)核的輔助診斷。根據(jù)2010年全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果，涂陰肺結(jié)核占我國肺結(jié)核患者的比率高達(dá)50%～85%。因此，核酸檢測試劑在結(jié)核病的輔助診斷中具有較高的價值。(2)核酸檢測試劑常用方法為熒光定量PCR法，從痰液樣本的前處理到檢測結(jié)果的報告，一般24 h之內(nèi)即可完成；而培養(yǎng)鑒定方法則長達(dá)1個月之久。因此，核酸檢測試劑可相對快速地鑒別MTBC菌株與非結(jié)核分枝桿菌，以對患者及早進(jìn)行正確的醫(yī)療處置。(3)核酸檢測試劑擴(kuò)增靶標(biāo)為MTBC特異的序列，目標(biāo)序列的檢出意味著樣本中存在MTBC菌株。相比于僅從形態(tài)上進(jìn)行區(qū)分的涂片方法(僅能從形態(tài)上判斷是否為分枝桿菌，無法區(qū)分MTBC和非結(jié)核分枝桿菌)，核酸檢測試劑可提高肺結(jié)核診斷的特異度[4-5]。

二、臨床試驗方案

在臨床試驗開始前，臨床試驗研究者應(yīng)與申請人一起討論，從流行病學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、統(tǒng)計學(xué)等多方面考慮，設(shè)計科學(xué)合理的臨床試驗方案。不同臨床試驗機(jī)構(gòu)的臨床試驗方案應(yīng)基本一致，便于進(jìn)行統(tǒng)計分析。臨床試驗過程應(yīng)嚴(yán)格遵守既定方案。臨床試驗方案應(yīng)確定嚴(yán)格、科學(xué)合理的樣本入選和排除標(biāo)準(zhǔn)。任何入選的樣本被排除出臨床試驗都應(yīng)進(jìn)行記錄并明確說明理由。臨床方案的設(shè)計應(yīng)嚴(yán)格遵守《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》[2]的相關(guān)要求。

三、臨床試驗機(jī)構(gòu)

MTBC核酸檢測試劑屬于第三類體外診斷試劑，應(yīng)在不少于3家(含3家)獲得國家食品藥品監(jiān)督管理總局資質(zhì)認(rèn)可的臨床試驗機(jī)構(gòu)進(jìn)行臨床試驗。目前，國家食品藥品監(jiān)督管理總局尚未公布已獲資質(zhì)認(rèn)可的臨床試驗機(jī)構(gòu)目錄，申請人可選擇省級以上衛(wèi)生醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展臨床試驗。申請人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品的特點及預(yù)期用途，綜合考慮不同地區(qū)人種、流行病學(xué)、病原微生物的特性等因素，合理選擇臨床試驗機(jī)構(gòu)。由于我國非結(jié)核分枝桿菌的分布存在較大的地域差異，為了更好地驗證申報產(chǎn)品的特異性，建議申請人在臨床試驗機(jī)構(gòu)選擇時應(yīng)注意其地域代表性。

四、臨床試驗用樣本

MTBC核酸檢測試劑的核心價值是提高涂陰結(jié)核病患者的檢出率，并進(jìn)行鑒別診斷。2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告顯示，由于地域和統(tǒng)計方法的差異，涂陽肺結(jié)核占所有肺結(jié)核患者的比率約在15%～50%[6]。審評過程中發(fā)現(xiàn)，在臨床試驗中，為了獲得較高的敏感度和特異度，申請人和臨床試驗機(jī)構(gòu)傾向于選擇涂陽肺結(jié)核患者作為病例組，選擇健康人作為對照組；而忽略了涂陰肺結(jié)核患者及易與肺結(jié)核相混淆的其他疾病的患者。這樣的病例選擇原則，無法真實地反映實際臨床發(fā)病特征，因此，無法對MTBC核酸檢測試劑在肺結(jié)核輔助診斷中的核心價值(即提高涂陰肺結(jié)核患者的檢出率和進(jìn)行鑒別診斷)進(jìn)行充分驗證。因此，建議申請人和臨床試驗機(jī)構(gòu)在選擇臨床試驗對象時應(yīng)充分考慮以下幾點[6-7]：(1)應(yīng)選擇具有肺結(jié)核癥狀和(或)體征的疑似肺結(jié)核患者，不建議選擇正常健康人群；(2)肺結(jié)核患者例數(shù)不少于350例，并且涂陰肺結(jié)核占所有肺結(jié)核患者的比率至少為50%；(3)應(yīng)包括其他易混淆疾病(如肺炎、肺癌等疾病)，此部分患者至少150例，以便對申報產(chǎn)品的特異度進(jìn)行評價。上述病例選擇的基本原則，在滿足相關(guān)法規(guī)規(guī)定的至少500例樣本的前提下，充分考慮了肺結(jié)核疾病的特性及臨床發(fā)病率，保證了臨床試驗評價的客觀性與科學(xué)性。

五、臨床試驗對比試劑

1.采用已上市同類產(chǎn)品作為對比試劑：迄今為止，國內(nèi)外至少已有25種MTBC核酸檢測試劑獲準(zhǔn)在中國上市。申請人可按照法規(guī)要求選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為對比試劑；采用申報產(chǎn)品與對比試劑進(jìn)行比較研究，證明申報產(chǎn)品與已上市的同類產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。

鑒于目前獲準(zhǔn)上市的同類試劑的靶基因及敏感度等性能可能存在差異，建議申請人在進(jìn)行臨床試驗前，選擇幾家上市試劑進(jìn)行預(yù)試驗，以便選擇與申報產(chǎn)品性能相似，且臨床認(rèn)為質(zhì)量較好的同類試劑作為對比試劑。

申請人應(yīng)選擇至少500例臨床樣本，采用申報產(chǎn)品與對比試劑進(jìn)行比對試驗，以評價申報產(chǎn)品與已上市產(chǎn)品的等效性。同時，申請人還應(yīng)選擇至少100例臨床樣本(涂陰和涂陽分別至少50例)進(jìn)行申報產(chǎn)品與培養(yǎng)鑒定方法(金標(biāo)準(zhǔn))的對比研究，以評價申報產(chǎn)品的臨床敏感度和特異度。培養(yǎng)方法可以采用傳統(tǒng)的羅氏固體培養(yǎng)或液體培養(yǎng)方法，菌種鑒定方法可采用對硝基苯甲酸、測序或其他已上市的核酸檢測試劑盒等[8-9]。

2.選擇基因測序作為對比方法：隨著基因測序的普及，其在臨床的應(yīng)用也越來越廣泛。而且，由于基因測序的成本較低，且是分子生物學(xué)方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”，基因測序在核酸類檢測試劑的臨床試驗中受到很多申請人的青睞。但是，鑒于測序步驟復(fù)雜且耗費勞動力，雖然很多臨床試驗機(jī)構(gòu)配備了測序儀，但是愿意開展測序業(yè)務(wù)的臨床試驗機(jī)構(gòu)非常少。因此，提醒申請人和臨床試驗機(jī)構(gòu)在選擇基因測序作為金標(biāo)準(zhǔn)時，應(yīng)充分考慮臨床試驗的可行性及延續(xù)性。如果選擇了該方法作為對比方法，應(yīng)在臨床試驗資料中對選用的基因測序方法做詳細(xì)的介紹，包括如下幾點：(1)提供測序原理、測序儀型號、測序試劑、測序引物等信息；(2)驗證測序方法的分析性能(如最低檢測限)，建議將測序方法與申報產(chǎn)品的性能進(jìn)行比對分析；(3)提交有代表性的樣本測序圖譜及結(jié)果分析；(4)測序方法還應(yīng)設(shè)置陽性和陰性質(zhì)量控制。所有測序資料均需要臨床試驗機(jī)構(gòu)蓋章，不可由申請人與第三方測序機(jī)構(gòu)簽署委托測序協(xié)議。

六、樣本前處理方法和核酸提取方法的臨床驗證

痰液是MTBC核酸檢測試劑最常用的樣本類型。在進(jìn)行樣本核酸提取前，需先對痰液樣本進(jìn)行液化除菌等前處理。目前臨床常用的痰液前處理方法至少有3種，分別為堿處理-直接法、N-乙酰-L-半胱氨酸法和堿處理-中和離心沉淀法等[8]。如果申報產(chǎn)品涉及幾種樣本前處理方法，在臨床試驗時，建議至少進(jìn)行150例同源樣本(1份臨床樣本分成幾份，分別采用不同的前處理方法進(jìn)行處理)的臨床比對。其中，肺結(jié)核至少100例(涂陰肺結(jié)核占所有肺結(jié)核的比率至少為50%)，其他易混淆疾病的樣本至少50例[6-7]。

目前，國家食品藥品監(jiān)督管理總局并未要求申報產(chǎn)品試劑盒的組成中必須包括核酸提取成分。因此，申請人在設(shè)計開發(fā)產(chǎn)品時，其試劑盒本身往往并不包括核酸提取成分，而是配套使用其他廠家的一種或多種核酸提取試劑盒，用于申報產(chǎn)品樣本的核酸提取。如申報產(chǎn)品稱痰樣本可采用幾種方法進(jìn)行核酸提取，在臨床試驗中，建議至少進(jìn)行150例同源樣本(1份臨床樣本分成幾份，分別采用不同的核酸提取方法進(jìn)行處理)的臨床比對。其中，肺結(jié)核至少100例(涂陰肺結(jié)核占所有肺結(jié)核的比率至少為50%)，其他易混淆疾病的樣本至少50例[6-7]。

七、臨床試驗報告中需要注意的其他問題

臨床試驗報告中需要注意的其他問題包括如下幾點：(1)應(yīng)在臨床試驗報告中詳細(xì)描述申報產(chǎn)品與對比試劑的試驗方法，并與試劑盒的說明書保持一致。(2)應(yīng)在臨床報告中明確總樣本數(shù)、肺結(jié)核患者總例數(shù)、涂陰和涂陽肺結(jié)核患者數(shù)、易混淆疾病患者例數(shù)，以便判斷病例選擇的合理性。(3)臨床原始數(shù)據(jù)應(yīng)包括患者的年齡、性別、涂片結(jié)果、臨床診斷結(jié)果(明確為何種疾病，而不是癥狀的描述)、申報產(chǎn)品的結(jié)果、對比試劑的結(jié)果等。(4)結(jié)果差異樣本的處理方法。

對于申報產(chǎn)品和對比試劑檢測結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用金標(biāo)準(zhǔn)或其他合理的方法進(jìn)行復(fù)核，同時結(jié)合患者的臨床病情對產(chǎn)生差異的原因及可能的結(jié)果進(jìn)行分析。

相比于病毒而言，細(xì)菌的基礎(chǔ)研究和臨床實踐相對滯后。鑒于結(jié)核病診斷的復(fù)雜性，MTBC核酸檢測試劑的臨床設(shè)計和臨床試驗較其他病原體檢測試劑更為復(fù)雜。為了從臨床角度驗證申報產(chǎn)品的敏感度和特異度，希望臨床試驗機(jī)構(gòu)和申請人在設(shè)計此類試劑的臨床試驗方案時，不僅要考慮對比試劑選擇的合理性，更要考慮臨床研究樣本選擇的科學(xué)性，在設(shè)定病例入選和刪除標(biāo)準(zhǔn)時要非常謹(jǐn)慎。

[1] Bloemberg GV, Voit A, Ritter C, et al．Evaluation of Cobas TaqMan MTB for direct detection of theMycobacteriumtuberculosiscomplex in comparison with Cobas Amplicor MTB．J Clin Microbiol, 2013, 51(7)：2112-2117．

[2] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局．關(guān)于發(fā)布體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則的通告[EB/OL].(2014-09-11)[2016-06-21]. http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0087/106241.html.

[3] U.S．Food and Drug Administration．Class 11 special controls guideline：nucleic acid-based in vitro diagnostic devices for the detection ofMycobacteriumtuberculosiscomplex in respiratory specimens-guideline for industry and Food and Drug Administration Staff[EB/OL]．(2014-05-30)[2016-06-21]．http://www.fda.gov/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/ucm357617.htm.

[4] 路曉紅, 付玉榮, 伊正君. 基于核酸檢測診斷結(jié)核分枝桿菌感染的研究進(jìn)展. 中國人獸共患病學(xué)報, 2015, 31(10)：967-971.

[5] 盧水華，肖和平. 結(jié)核病診斷新技術(shù)及其評價. 中國實用內(nèi)科雜志，2015，35(8)：651-654.

[6] 全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組，全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室. 2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告.中國防癆雜志，2012，34(8)：485-505.

[7] U.S．Food and Drug Administration．Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests[EB/OL]．(2007-03-13)[2016-06-21]．http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm.

[8] 中華醫(yī)學(xué)會.臨床技術(shù)操作規(guī)范：結(jié)核病分冊. 北京：人民軍醫(yī)出版社，2004.

[9] 梁瑞霞, 谷蘊(yùn)婷, 董偉杰, 等. 兩種分子檢測技術(shù)快速診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核及其耐藥性的研究.中國防癆雜志, 2015, 37(11)：1126-1129.

(本文編輯：李敬文)

Analysis of key points of clinical trail using nucleic acid reagent ofMycobacteriumtuberculosiscomplex

LIURong-zhi,LIYao-hua.

CenterForMedicalDeviceEvaluation,ChinaFoodandDrugAdministration,Beijing100044,China

LIYao-hua,Email:liyh@cmde.org.cn

Nucleic acid reagent ofMycobacteriumtuberculosiscomplex could increase the detection rate of smear-negative pulmonary tuberculosis and the specificity of pulmonary tuberculosis diagnosis, and identifyMycobacteriumtuberculosiscomplex and non-tuberculous mycobacteria more rapidly. When this reagent used in clinical trials, the choose of clinical trial institution, sample and contrast reagents, etc., and clinical verification of sample processing and nucleic acid extraction method should be concerned. The above key issues would be analyzed in this paper.

Mycobacteriumtuberculosis; Nucleic acids; Clinical trial; Reagent kits, diagnostic

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.09.015

100044 北京，國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心

李耀華，Email：liyh@cmde.org.cn

2016-06-21)