胡嚴(yán)杰 黃海榮

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·綜述·

結(jié)核分枝桿菌對吡嗪酰胺耐藥的檢測方法研究與進(jìn)展

胡嚴(yán)杰 黃海榮

吡嗪酰胺(pyrazinamide, PZA)是重要的一線抗結(jié)核藥物之一，對細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌具有獨(dú)特的殺菌作用，因此成為結(jié)核病短程化療的基石。同時，鑒于目前治療耐多藥結(jié)核病新藥的缺乏，WHO建議全程使用PZA治療耐多藥結(jié)核病。結(jié)核分枝桿菌對PZA耐藥的相關(guān)基因pncA及其啟動子區(qū)的突變位置分散且類型繁多，使一般的分子學(xué)診斷方法不易進(jìn)行操作與檢測。作者對現(xiàn)有的PZA耐藥性檢測方法的原理及新檢測方法的研究進(jìn)行綜述與展望。

吡嗪酰胺； 分枝桿菌, 結(jié)核； 微生物敏感性試驗(yàn)； 表型； 基因型； 實(shí)驗(yàn)室技術(shù)和方法； 綜述

2015年全球新增結(jié)核病患者約960萬例，其中3.3%的初治患者和20%的復(fù)治患者為耐多藥結(jié)核病患者[1]。吡嗪酰胺(pyrazinamide, PZA)可殺死處于半休眠期的結(jié)核分枝桿菌，從而將治療周期從9～12個月縮短至6個月，因而成為結(jié)核病短程化療的基石[2-3]。近年來有研究表明，使用PZA治療的原發(fā)耐多藥結(jié)核病患者的預(yù)后優(yōu)于未使用的患者[4]，因此，世界衛(wèi)生組織(WHO)建議使用PZA應(yīng)貫穿耐多藥結(jié)核病患者的整個療程。然而，由于對PZA的藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)需要特殊的酸性環(huán)境，使得其不易操作且結(jié)果可重復(fù)性差，因此對PZA的藥物敏感性檢測并未常規(guī)納入日常的藥敏試驗(yàn)[5]。由于臨床對PZA藥敏試驗(yàn)的需求，可靠的方法一直處于尋求、探索過程中，筆者將分別對PZA耐藥的表型檢測方法和分子檢測方法的檢測原理、特點(diǎn)進(jìn)行綜述。

表型藥敏試驗(yàn)方法

PZA是一種煙酰胺類似物，被轉(zhuǎn)運(yùn)到巨噬細(xì)胞內(nèi)后在吡嗪酰胺酶(pyrazinamidase, PZase)的作用下生成吡嗪酸(pyrazinoic acid, POA)進(jìn)而發(fā)揮抗結(jié)核作用[1]。POA在中性條件下以POA-的形式存在，一部分POA-通過外排作用轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，在酸性環(huán)境下，POA-被還原成不帶電荷的POA分子。由于POA的動態(tài)平衡，不帶電荷的分子再次被轉(zhuǎn)運(yùn)到結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)，進(jìn)入時帶入一個質(zhì)子，經(jīng)過大量累積后結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞質(zhì)酸化，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡[6-8]。表型藥敏試驗(yàn)方法是將結(jié)核分枝桿菌與藥物共同孵育一段時間后，通過直接或間接觀察細(xì)菌的存活狀態(tài)，判斷細(xì)菌是否耐受PZA。

一、根據(jù)菌量檢測的方法

1.BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)基法：是WHO推薦的一種液體培養(yǎng)檢測MTB對PZA是否敏感的方法，是目前應(yīng)用最為廣泛的PZA耐藥性檢測方法[9]。其原理是應(yīng)用BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)比較一定周期內(nèi)含藥培養(yǎng)管和對照管是否因耗氧量不同而激發(fā)產(chǎn)生不同強(qiáng)度的熒光，從而推測含藥培養(yǎng)管中的菌量占對照培養(yǎng)管菌量的比例，并由此判斷細(xì)菌是否耐受PZA。此方法中PZA的終濃度為100 μg/ml，液體培養(yǎng)基的pH值設(shè)定為6.0[10]，21 d后可得到檢測結(jié)果，是目前認(rèn)可度較高的PZA藥敏試驗(yàn)方法。歐洲的一項(xiàng)研究以BACTEC 460為參照標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用MGIT 960系統(tǒng)進(jìn)行的PZA藥敏試驗(yàn)結(jié)果與其一致率達(dá)到98.3%[10]。

2.VersaTREK-ESP System Ⅱ的PZA藥敏試驗(yàn)法：其原理是將VersaTREK全自動微生物探測系統(tǒng)(VTI)及ESP?培養(yǎng)系統(tǒng)Ⅱ(ESP)配合使用，通過連續(xù)監(jiān)測(24 min/次，若無陽性信號出現(xiàn)，最多檢測12 d)培養(yǎng)瓶頂空中氧氣的消耗率檢測分枝桿菌的生長，并通過陽性信號報告生長響應(yīng)。在生長對照瓶檢測報陽后3 d內(nèi)含藥生長瓶也報陽則為耐藥，反之則為敏感。此方法同樣需要酸性環(huán)境，PZA終濃度為300 μg/ml，但僅需14 d即可得到結(jié)果。該方法檢測結(jié)果文獻(xiàn)報道顯示，以BACTEC 460為金標(biāo)準(zhǔn)，該方法的敏感度為88.0%，特異度為92.3%[11]。Espasa等[11]的一項(xiàng)以BACTEC MGIT 960為對照的研究中，顯示其敏感度和特異度分別為97.0%和100.0%。

以上兩種方法均需要昂貴的設(shè)備和試劑，影響了其在臨床上的全面推廣，而且越來越多的報道認(rèn)為此類藥敏試驗(yàn)的可重復(fù)性不夠理想，原因可能有以下幾種因素：(1)酸性環(huán)境不利于結(jié)核分枝桿菌的生長[12]；(2)接種量依靠比濁法稀釋細(xì)菌確定，肉眼觀察誤差較大，易出現(xiàn)假陽性[13]；(3)PZA對不同生長狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌的殺傷力不相同[14]。

二、PZase活性檢測法

1.韋恩法(Wayne法)：在PZase催化下PZA轉(zhuǎn)化為具有還原性的POA，而轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)菌膜外的POA分子可與硫酸亞鐵氨發(fā)生反應(yīng)生成紅色的硫酸亞鐵。將結(jié)核分枝桿菌接種到含有PZA的固體培養(yǎng)基上，4 d后向培養(yǎng)基上滴加硫酸亞鐵銨，通過觀察培養(yǎng)基顏色變化可以推測是否有POA生成，從而判斷PZase是否具有活性。PZase有活性表明細(xì)菌對PZA敏感，否則判定為耐藥。Cui等[10]的一項(xiàng)研究表明，以MGIT 960系統(tǒng)進(jìn)行的PZA藥敏試驗(yàn)作為對照，Wayne法的敏感度為88.2%，特異度為98.5%。該方法操作簡單，特異度較高且檢測周期短，但其敏感度較低，操作需要菌量較大，可重復(fù)性較差，因此沒有得到廣泛認(rèn)可[15-16]。

2.底物類似物顯色法：煙酰胺是PZA類似物，其也能在PZase的作用下轉(zhuǎn)化成活性狀態(tài)，且該轉(zhuǎn)化無需酸性環(huán)境，因此有學(xué)者嘗試用煙酰胺替代PZA作為底物檢測結(jié)核分枝桿菌的PZase活性[17]。本方法的基本原理與Wayne法相似，但結(jié)果判定采用結(jié)核分枝桿菌液體藥敏試驗(yàn)常用的比色法。常見的比色法包括：刃天青微量滴定分析法(resazurinmicrotiter assay, REMA)、硝酸鹽還原法(nitrate reductase assay, NRA)和噻唑藍(lán)比色法(MTT法)。Cui等[10]的一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，以MGIT 960法為標(biāo)準(zhǔn)，MTT法的敏感度為97.0%，特異度為99.6%。而泰國的一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，以MGIT 960法作為對照，MTT的敏感度僅為88.0%，特異度為78.0%[18]。比色法操作簡便，不需要特殊儀器，結(jié)果易于判定，成本低，且能在10～14 d得到藥敏試驗(yàn)結(jié)果。該方法利用煙酰胺替代PZA，解決了檢測pH值和結(jié)核分枝桿菌生長所需pH值矛盾的問題；但該方法缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，因此尚無法推廣[10,17]。

耐藥基因突變檢測技術(shù)

PZase是由MTB的pncA基因編碼的蛋白，研究表明pncA基因及其啟動子區(qū)序列的突變是造成PZase活性降低或缺失的主要原因[19]，也是對PZA產(chǎn)生耐藥的主要原因。

pncA基因全長561 bp，基因及其啟動子序列的突變形式包括點(diǎn)突變、插入和缺失，可能發(fā)生突變的堿基幾乎覆蓋了整個基因，因此不便于應(yīng)用常用的基于探針雜交的分子檢測技術(shù)，諸如分子信標(biāo)法、TaqMan探針法等。同時，有報道認(rèn)為pncA基因突變不一定造成PZA耐藥，如Ramirez-Busby等[20]的Meta分析發(fā)現(xiàn)83%的pncA基因突變會造成對PZA耐藥，而17%的pncA基因突變不會造成耐藥。這一因素大大削弱了通過檢測pncA基因及其啟動子區(qū)的序列差異來診斷結(jié)核分枝桿菌對PZA耐藥的價值。不過，鑒于作為對照方法的結(jié)核分枝桿菌PZA耐藥表型藥敏試驗(yàn)方法存在不可靠的問題，分子檢測技術(shù)的真實(shí)價值仍有待更多的評估，而鑒于其耗時短的優(yōu)勢，因此這一領(lǐng)域仍然激發(fā)了很多研究興趣。

1. DNA序列測定技術(shù)：DNA測序技術(shù)是一種分析特定DNA序列堿基排列的技術(shù)，可以對DNA的突變進(jìn)行定位和鑒定研究。2011年的一篇綜述分析顯示，以MGIT 960法作為對照，DNA測序技術(shù)診斷結(jié)核分枝桿菌對PZA耐藥的敏感度和特異度分別為90.0%和 94.0%；以BACTEC 460法為標(biāo)準(zhǔn)時，DNA測序技術(shù)的敏感度和特異度分別為87.0%和95.0%；以MGIT 960法作為對照時，DNA測序技術(shù)的敏感度和特異度分別為85.0%和88.0%[21]。DNA測序技術(shù)是突變檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，隨著該技術(shù)自動化程度的提高及成本的降低，DNA測序技術(shù)將成為未來基因檢測的常規(guī)手段。

2. Surveyor酶酶切法：Surveyor酶是植物中提取的核酸內(nèi)切酶，它與普通內(nèi)切酶不同之處在于其可特異性切割DNA錯配部位，這種切割對核苷酸序列無特殊要求，不需要知曉pncA突變的具體位置和類型[22]。該方法先將野生型pncA基因的PCR產(chǎn)物和待測樣品的pncA基因的PCR產(chǎn)物混合，在變性和復(fù)性過程中，形成同源或異源雙鏈，在Surveyor 酶作用后電泳，如果待測樣品沒有突變、插入和缺失位點(diǎn)，則Surveyor酶不能發(fā)揮作用，電泳圖譜上僅有單個條帶；如果待測樣品含有突變、插入和缺失位點(diǎn)，則形成一條異源雙鏈和一條同源雙鏈，此時Surveyor酶發(fā)揮作用，將異源雙鏈切斷，此時電泳圖譜上有3條或者更多條帶[22]。有一項(xiàng)研究采用該方法分析了10株臨床分離株對PZA的耐藥性，僅有1株與PZase活性檢測結(jié)果不一致[23]。采用Surveyor酶酶切法操作簡單，無需特殊儀器，具有推廣價值。該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在其他疾病的基因突變檢測，但在結(jié)核病檢測方面應(yīng)用較少。

3. 高分辨率熔解曲線(high resolution melt，HRM)：HRM是新近發(fā)展起來的建立在實(shí)時熒光定量PCR基礎(chǔ)上的突變檢測技術(shù)。HRM將野生型樣品和待測樣品加到同一樣本管中進(jìn)行PCR后雜交形成同源或異源雙鏈，利用飽和熒光染料能與雙鏈DNA進(jìn)行特異性結(jié)合，利用同源雙鏈和異源雙鏈的熔解溫度不同、熒光染料脫落的溫度也不相同來區(qū)分野生型和突變型。該方法通過設(shè)計交叉引物覆蓋pncA及其啟動子序列，通過多管檢測即可分析出pncA及其啟動子序列的基因型，不需要知道突變的堿基位點(diǎn)和突變類型。有研究者用HRM技術(shù)分析了127株臨床分離株，并與BACTEC MGIT 960藥敏試驗(yàn)結(jié)果對比，其敏感度為85.5%，特異度為98.5%[24]。HRM法是閉管檢測，從而避免了污染造成的假陽性。目前，HRM技術(shù)已經(jīng)在結(jié)核病耐藥分子診斷領(lǐng)域得到應(yīng)用，未來此項(xiàng)技術(shù)也有希望用于結(jié)核分枝桿菌對PZA耐藥的分子檢測。

4. 微陣列技術(shù)：微陣列片技術(shù)采用原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將已知序列的DNA片段固定在支持物表面，然后采用含有特異性標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測特異性信號強(qiáng)度來獲取樣品的序列信息。有研究者設(shè)計了79種特異性探針序列檢測結(jié)核分枝桿菌對PZA耐藥的pncA基因，其結(jié)果與測序一致[25]。這說明該方法具有很高的敏感度和特異度，可快速識別設(shè)定的突變位點(diǎn)，但微陣列技術(shù)需要大量探針，且雜交過程操作復(fù)雜，因此易于發(fā)生污染。未來自動化技術(shù)的發(fā)展可能有助于解決這些問題，但是此技術(shù)需要昂貴的儀器設(shè)備，極大地限制了該技術(shù)的臨床應(yīng)用。

問題和展望

雖然臨床目前對PZA進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的檢測技術(shù)很多，但現(xiàn)有技術(shù)都存在不同程度的缺陷。對PZA進(jìn)行表型藥敏試驗(yàn)的難點(diǎn)在于液體培養(yǎng)技術(shù)需要pH=5.5～6.0的條件，而結(jié)核分枝桿菌的生長需要中性環(huán)境，從而可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)；比色法和產(chǎn)物顯色法均不能區(qū)分PZase的活性高低，容易導(dǎo)致假陰性結(jié)果出現(xiàn)；基因突變檢測技術(shù)需要首先建立結(jié)核分枝桿菌對PZA耐藥與基因突變間良好的一致性關(guān)系。目前，PZA的殺菌機(jī)制還未完全闡明，相信隨著對其殺菌機(jī)制和耐藥機(jī)制研究的不斷深入，同時隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，未來一定能夠建立可靠而實(shí)用的PZA藥敏試驗(yàn)的檢測方法。

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(本文編輯：王然 李敬文)

Progress of pyrazinamide-resistanceMycobacteriumtuberculosisdetection

HUYan-jie,HUANGHai-rong.

NationalTuberculosisClinicalLaboratory,BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute,Beijing101149,China

HUANGhai-rong,Email:huanghairong@tb123.org

Pyrazinamide (PZA) is one of the most potent anti-tuberculosis (TB) drugs which has unique bactericidal activity within cells, therefore, it is the core of short-course chemotherapy for TB. Recently, WHO suggested using PZA through out the treatment course of multiple drug-resistant TB because of lack of new drugs. As location of the mutation in the promoter is scattered and the types are various,pncAgene, which is related with PZA-resistant, is difficult to be detected using the general molecular test. In this article, the advancement of PZA-resistance TB detection will be reviewed.

Pyrazinamide;Mycobacteriumtuberculosis; Microbial sensitivity tests; Phenotype; Genotyp; Laboratory techniques and procedures; Review

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.09.014

101149 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所 國家結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室

黃海榮，Email：huanghairong@tb123.org

2016-07-05)