姜廣路 黃海榮

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中國結核分枝桿菌表型藥物敏感性試驗方法標準回顧

姜廣路 黃海榮

中國耐藥結核病疫情依然嚴峻，結核分枝桿菌表型藥物敏感性檢測方法在耐藥結核病的診斷中占有重要地位。鑒于目前國內結核病實驗室檢測指南中同時規(guī)定絕對濃度法和比例法為標準方法，且兩者操作步驟有很大不同，對患者治療、耐藥監(jiān)測造成困惑。因此，有必要了解國內耐藥結核病檢測方法的發(fā)展過程，以利于檢測方法的規(guī)范化。作者回顧了我國結核分枝桿菌藥物敏感性檢測標準的歷史，總結問題并提出建議，以期為結核分枝桿菌藥物敏感性試驗臨床檢測標準的優(yōu)化提供有價值的信息。

分枝桿菌，結核； 結核, 抗多種藥物性； 微生物敏感性試驗； 參考標準

我國結核病控制目前面臨的主要挑戰(zhàn)為耐藥、人口流動、MTB和HIV雙重感染，其中結核病耐藥問題尤為突出。自2006年開展耐多藥結核病控制項目以來，結核分枝桿菌的耐藥性測定日益發(fā)揮著重要作用。雖然近年來以檢測耐藥基因突變?yōu)槭侄蔚哪退幏肿釉\斷技術發(fā)展迅猛，但已知耐藥基因突變無法完全解釋結核分枝桿菌耐藥現(xiàn)狀。這就決定其無法完全替代表型藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)。細菌學檢測具有直觀和價廉的優(yōu)點，因此，表型藥敏試驗仍是目前診斷結核分枝桿菌耐藥的“金標準”。國內多數實驗室仍主要采用以羅氏培養(yǎng)基為基礎的結核分枝桿菌藥敏試驗。目前，各實驗室應用的方法尚未統(tǒng)一，包括絕對濃度法、比例法、分枝桿菌生長指示管(Mycobacteria growth indicator tube，MGIT)法等，甚至同一實驗室針對不同目的也采用了不同方法和判定標準。鑒于此，有必要對抗結核藥物敏感性檢測方法進行標準化?；仡櫸覈Y核分枝桿菌藥敏試驗方法發(fā)展的歷史，有助于深入了解各種方法的由來，并對其進行優(yōu)化和標準化，從而提高藥敏試驗結果的可靠性。

一、1963年以前中國抗結核藥物的藥敏試驗方法回顧

異煙肼于1912年被合成，鏈霉素和對氨基水楊酸均在1944年被發(fā)現(xiàn)、合成。這些藥物隨之用于治療結核病。隨著藥物應用范圍的擴大，臨床觀察到的抗結核藥物療效降低的情況越來越多，了解結核分枝桿菌抗藥性的臨床需求越來越大，因此耐藥性檢測方法得以建立和發(fā)展。最初的結核分枝桿菌耐藥性檢測主要是針對上述3種藥物。

1946年，Youmans和Williston[1]即開始對鏈霉素的結核分枝桿菌耐藥菌株進行研究。1952年，Wilking等[2]通過對結核分枝桿菌鏈霉素耐藥菌株的研究，將鏈霉素耐藥界限定為10 μg/ml。1953年，中國學者何長清[3]將相關文章翻譯并發(fā)表，在我國首次提出鏈霉素耐藥界限應設定為10 μg/ml。

1954年，北京協(xié)和醫(yī)院細菌免疫系王鳳連教授參考Youmans、Fairbrother等的方法，開展了鏈霉素和異煙肼耐藥性檢測的研究[4]。其方法是將標本處理后直接接種于豌豆瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中鏈霉素濃度分別為100、10、1、0.1 μg/ml，如發(fā)現(xiàn)有菌落生長報告高度耐藥、中度耐藥、中度敏感、高度敏感，其中低度耐藥界限設定為10 μg/ml；培養(yǎng)基中異煙肼的濃度分別為10、1、0.1、0.01 μg/ml，其中低度耐藥界限設定為1 μg/ml。這是國內開展的最早的結核分枝桿菌藥敏試驗。

1955年，郭均[5]使用羅氏培養(yǎng)基進行異煙肼間接法耐藥性檢測，培養(yǎng)基內異煙肼濃度分別為0.1、1、10、100 μg/ml，耐藥界限設定為1 μg/ml，并報告了異煙肼與鏈霉素、異煙肼與對氨基水楊酸聯(lián)合用藥出現(xiàn)耐藥較少的現(xiàn)象。1957年，吳紹青[6]在討論結核分枝桿菌異煙肼耐藥菌株與致病力關系中提及，英國醫(yī)學研究委員會于1953年規(guī)定結核分枝桿菌藥敏試驗異煙肼的濃度界限為0.2 μg/ml。

二、絕對濃度法和比例法的溯源

1963年，世界衛(wèi)生組織(WHO)公報提出了結核分枝桿菌藥敏試驗比例法、絕對濃度法、比率法等3種方法的概念[7]，并提出國際防癆聯(lián)盟推薦以不加淀粉的羅氏培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基。在此公報中，Gertrud Meissner(德國)提出了絕對濃度法藥敏試驗方法，含藥培養(yǎng)基中藥物濃度為：異煙肼濃度為0.2 μg/ml和1 μg/ml、鏈霉素(雙氫硫酸鏈霉素)濃度為5 μg/ml和10 μg/ml、對氨基水楊酸濃度為0.5 μg/ml和2 μg/ml，不同的藥物濃度代表細菌不同的耐藥程度；耐藥濃度界限為：異煙肼0.2 μg/ml、鏈霉素5 μg/ml、對氨基水楊酸0.5 μg/ml。培養(yǎng)基凝固溫度為82～85 ℃，時間為40～60 min，只凝固1次。接種方法為麥氏1號管稀釋50倍，取一接種環(huán)(約10 μl)接種培養(yǎng)基，理論上接種量為2000～10 000 個菌，即10-4mg/ml。孵育4周，如生長不良則延長1～2周。如含藥培養(yǎng)基上菌落數的絕對數少于20個，即2000個細菌的1%，則報告敏感。文中特別提出，每個實驗室制定耐藥界限濃度應以實驗數據為依據。

Canetti等[7-8]分別在1963年和1969年WHO 公報中2次報道了比例法藥敏試驗方法，該方法常規(guī)檢測含藥培養(yǎng)基中的藥物濃度：異煙肼為0.2 μg/ml和1 μg/ml、鏈霉素(雙氫硫酸鏈霉素)為4 μg/ml和10 μg/ml、對氨基水楊酸為0.5 μg/ml和1 μg/ml；耐藥濃度界限為：異煙肼為0.2 μg/ml、鏈霉素(雙氫硫酸鏈霉素)為4 μg/ml、對氨基水楊酸為0.5 μg/ml。當含藥培養(yǎng)基上生長菌落數達到或大于對照培養(yǎng)基的1%時，即為耐藥。如果用于研究待測菌不同藥物濃度的耐藥情況時，才將含藥濃度范圍擴大，異煙肼濃度分別為0.1、0.2、1、5 μg/ml，鏈霉素(雙氫硫酸鏈霉素)分別為2、4、10、100 μg/ml，對氨基水楊酸分別為0.25、0.5、1、10 μg/ml。由此可見，從創(chuàng)立之初，絕對濃度法和比例法常規(guī)檢測的原理和含藥濃度是相同或相近的。只有用于科研時，異煙肼濃度才大于1 μg/ml，鏈霉素濃度可達到100 μg/ml，對氨基水楊酸濃度可達到10 μg/ml，這些濃度恰恰成為了中國絕對濃度法的藥物高濃度。1969年的WHO公報又進一步明確了比例法的地位，并豐富了測定藥物的種類，提出了“原發(fā)耐藥、獲得性耐藥”的概念，并重點論述了確定濃度界限的方法[8]。這成為了1996年WHO和國際防癆和肺部疾病聯(lián)合會組織的結核病耐藥性監(jiān)測項目中藥敏試驗方法的基礎[7]。

1963年，《中國防癆雜志》刊登了1963年6月3日的全國結核病學術會議《關于測定結核菌對藥物敏感性試驗方法的意見》(簡稱《意見》)一文[9]，文中沿用含淀粉的羅氏培養(yǎng)基，間歇加熱2次，分別為85 ℃ 40 min和80 ℃ 30 min，細菌接種量為0.1 mg, 即1 mg/ml接種0.1 ml，異煙肼濃度為0.1、1、10 μg/ml，鏈霉素(未強調使用雙氫硫酸鏈霉素，但強調鏈霉素加熱后易失效，要求培養(yǎng)基加熱凝固前鏈霉素實際濃度雙倍于規(guī)定濃度，即加入雙倍量的鏈霉素)濃度分別為1、10、100 μg/ml，對氨基水楊酸濃度分別為0.1、1、10 μg/ml。孵育4周報告結果，是否耐藥待后期與臨床進行比對決定。此意見存在以下幾個特點：(1)羅氏培養(yǎng)基含有淀粉；(2)培養(yǎng)基制備藥物因二次加熱而導致?lián)p耗大；(3)細菌接種量大；(4)含藥物濃度介于WHO規(guī)定耐藥界限的兩側。以上幾個特點導致將來確定藥物濃度界限時會選擇高濃度。另外，實驗室并不進行獨立判定藥敏試驗結果，而是與臨床治療結果比對后決定，這導致后期(1996年)國內絕對濃度法的應用指南中未規(guī)定耐藥判讀標準，對臨床醫(yī)生造成一定困擾。

1964年，高東哲和鄭翼宗[10-11]就結核分枝桿菌耐藥性測定方法中的細菌接種量進行了研究。該研究使用的羅氏培養(yǎng)基仍沿用凝固2次的方法，提出了使用0.5%失水山梨醇單油酸酯聚氧乙烯醚(Tween-80)均勻液體培養(yǎng)基生長方法制備的菌液較瑪瑙乳缽研磨法和錐形瓶玻璃珠振蕩法更均勻，并認為1963年《意見》中提出的細菌接種量0.1 mg的數值過大，細菌接種量在10-3～10-4mg較為適合。

1965年，陳惠蘭和王小天[12]使用11例初治患者的分離菌株，對1963年《意見》規(guī)定方法進行研究。研究中，羅氏培養(yǎng)基凝固2次，鏈霉素量加倍但效價為1，對氨基水楊酸效價為0.72；菌液濃度為1 mg/ml，分別以滴管和直徑3 mm接種環(huán)接種0.1 ml 和一環(huán)(近0.01 ml)，孵育4～8周。研究結論為報告時間以4周為宜，菌量高低的影響不大，異煙肼、鏈霉素、對氨基水楊酸濃度界限分別為0.5、2、1 μg/ml為宜。

1980年，吳愛棣[13]對利福平耐藥性方法進行研究，以確定利福平藥敏試驗濃度界限。研究使用的羅氏培養(yǎng)基凝固2次(85 ℃ 1 h，隔日后80 ℃ 1 h)，所用菌株分別來自從未用過利福平的患者(45例)，以及使用利福平1個月至3年的患者(43例)，接種量為10-3mg(10-2mg/ml接種0.1 ml)，含藥培養(yǎng)基菌落超過10個為耐藥。研究結論認為，利福平耐藥的濃度界限應設定為50和200 μg/ml。

1980年，中華醫(yī)學會結核病學分會總結1979年11月的“全國結核病防治學術會議”的專家意見，出版了《抗結核藥物耐藥性測定暫行規(guī)定》[14]，規(guī)定所用培養(yǎng)基為羅氏培養(yǎng)基，測定藥物種類和濃度(單位為μg/ml)分別是：鏈霉素(10、100)、異煙肼(1、10)、利福平(50、250)、乙胺丁醇(5、50)、卷曲霉素(10、100)、對氨基水楊酸(1、10)、卡那霉素(10、100)、乙硫異煙胺(25、100)、環(huán)絲氨酸(50、200)、氨硫脲(10、100)，接種量為10-2mg，含藥培養(yǎng)基生長11個菌落及以上判定為耐藥，低濃度含藥培養(yǎng)基耐藥即認為耐藥。特別注明制備鏈霉素含藥培養(yǎng)基要加入2倍于規(guī)定濃度的鏈霉素，卡那霉素和卷曲霉素含藥培養(yǎng)基加入10倍于規(guī)定濃度的藥物。

中國防癆協(xié)會于1996年制定了《結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》[15]，涉及藥敏試驗方法的內容中去除了環(huán)絲氨酸，但鏈霉素仍為加入2倍量藥物，卡那霉素和卷曲霉素仍為加入10倍量藥物；接種量降低為10-3mg。此規(guī)程未明確指出耐藥結果判定標準，最大的變更是羅氏培養(yǎng)基不再加熱2次，但并無相應的藥物濃度改變和微生物實驗數據驗證。中國防癆協(xié)會2006年版的《結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[16]關于絕對濃度法結核分枝桿菌耐藥性測定的判讀，將“耐藥”定義為含藥培養(yǎng)基上菌落生長面積達到“+”及以上，最大的變更是制備含藥培養(yǎng)基時鏈霉素不再加倍，但卡那霉素和卷曲霉素仍加10倍量。許多結核病?？漆t(yī)院仍沿用此絕對濃度法的規(guī)程。

三、藥敏試驗方法的應用及比例法的引進推廣

20世紀60—90年代，國內結核病實驗室，包括預防體系的實驗室和醫(yī)療體系的實驗室，普遍應用絕對濃度法進行藥敏試驗，而且1990和2000年的全國結核病流行病學抽樣調查細菌學檢測方法均采用了絕對濃度法，其數據更便于與國內耐藥數據比較。自1996年起，河南、山東等多個省份在WHO支持下開展了結核病耐藥性監(jiān)測項目，所采用的是基于1963年和1969年WHO公報的比例法[17]，從此比例法藥敏試驗開始在結核病預防體系的實驗室應用。進入21世紀以來，由于結核病預防體系實驗室方法進一步統(tǒng)一，且較多國際合作和國際交流項目的開展，促使了比例法藥敏試驗的普及。2007年全國結核病耐藥基線調查和2010年全國結核病流行病學抽樣調查采用比例法藥物敏感性測定方法，其結果更便于同世界各國的耐藥數據比較。

四、絕對濃度法和比例法的差異及相關研究

由于絕對濃度法和比例法同時在國內實驗室應用，甚至同一實驗室針對不同工作目的，采用不同方法。造成諸多耐藥結果不可比較，是否統(tǒng)一方法也成為爭論的熱點，因此國內很多學者就藥敏試驗方法的改良、絕對濃度法和比例法一致性進行過多項研究。張莉等[18]、楊立濤等[19]、陳裕等[20]均認為最佳菌液濃度是10-2和10-4mg/ml。劉宇紅等[21]研究表明，比例法和絕對濃度法藥敏試驗的異煙肼和乙胺丁醇結果存在明顯差異，但結果有差異的菌株的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)均在兩種方法耐藥濃度界限之間。丁北川等[22]研究顯示，采用WHO推薦的比例法和絕對濃度法測定的耐藥結果一致，但比較WHO推薦的比例法和我國普遍采用的絕對濃度法獲得的藥敏試驗結果，異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇、利福平等結果均有差異，且異煙肼差異明顯。黎友倫等[23]研究認為，接種量10-3和10-4mg對藥敏試驗結果影響差異不明顯。

五、絕對濃度法與比例法的差異原因分析

回顧我國絕對濃度法和比例法的發(fā)展歷史，不難發(fā)現(xiàn)，這兩種方法原理均基于細菌的MIC。兩種藥敏試驗方法各有優(yōu)缺點。比例法設計從原理上對細菌接種量進行了矯正，一定程度上減少了細菌接種量對檢測結果的影響，但操作相對復雜；絕對濃度法操作簡單，但容易受到細菌接種量的影響，可重復性相對要差。絕對濃度法可以認為是一種簡化了濃度選擇的MIC法，也可認為是一種在精確細菌接種量情況下的比例法，兩種方法原理上完全相同，并無對立之處。

縱觀國內結核分枝桿菌耐藥性試驗絕對濃度法的標準發(fā)展歷史，對實驗對象的選擇、培養(yǎng)基制作、藥粉的效價和加入量、細菌接種量等因素存在與WHO公報不同之處，而且變更時缺乏微生物實驗數據支持。

在臨床病例方面，參考WHO公報和國際防癆聯(lián)盟公報，藥敏試驗方法的菌株來源是未治療患者菌株和治療失敗患者菌株，確定濃度界限是能將兩組菌株最大限度區(qū)分的濃度，才能被認為是源于臨床并指導臨床用藥的實驗室方法。因此，在確定藥敏試驗方法時，選擇患者標準方面需要進一步統(tǒng)一。

在實驗室方面，可能受間歇滅菌觀念的影響，最初國內羅氏培養(yǎng)基凝固規(guī)定為2次，造成對溫度敏感的藥物在培養(yǎng)基制備過程中大量降解。雖然通過增加藥量加以彌補，但用量增加的程度缺乏數據支持。1996年制定的《結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》[15]將羅氏培養(yǎng)基凝固次數改為1次，但藥物濃度并未改變，導致培養(yǎng)基內藥物含量偏高，因此實際應用中耐藥率降低。藥粉加倍是基于化學反應的考慮，并無微生物實驗數據驗證，導致與比例法的結果差異較大。

因結核分枝桿菌的細胞壁脂質較多，其在懸濁液中不易分散，早期缺乏統(tǒng)一的理想的細菌研磨器材。少數實驗室細菌研磨使用瑪瑙研缽，多數實驗室使用玻璃滴管在普通玻璃試管管壁研磨，導致結核分枝桿菌分散度不夠，接種后生長菌落數較少，這可能是提高接種量的原因之一。

以上因素導致國內絕對濃度法藥敏試驗的結果存在較大的偏差，表現(xiàn)為重復性差，與比例法藥敏試驗結果有較大差異。諸多學者對兩種方法的研究表明，兩種方法的差異主要原因集中于濃度界限差別較大的藥物，即藥物濃度差異所導致，而接種量在一定范圍內變化對藥敏試驗結果影響不大[20-22]。

六、藥敏試驗方法面臨挑戰(zhàn)

第一，目前表型藥敏試驗方法在疾病控制體系實驗室和醫(yī)療體系實驗室出現(xiàn)兩種方法并行的現(xiàn)象。疾病控制體系實驗室多采用比例法；醫(yī)院體系部分實驗室采用比例法，部分實驗室采用絕對濃度法。方法與結果的差異使臨床醫(yī)生對患者治療產生困惑，對公共衛(wèi)生醫(yī)生連續(xù)比較流行病學監(jiān)測數據造成困難。

第二，如前文所述，對于采用或者不采用某種藥敏試驗方法，多為相關規(guī)定所影響，或是WHO采用的方法，或是國內規(guī)定的方法，而國內相關規(guī)定卻缺乏足夠的適合我國實際情況的實驗室數據的支持。

第三，即使是WHO推薦的比例法，仍有值得探討之處。張健源等[24]研究認為，增大接種量可以發(fā)現(xiàn)更多耐藥菌株。張楠等[25]通過檢測基因突變，認為乙胺丁醇的濃度界限應從2 μg/ml降為1.6 μg/ml。

此外，目前比例法的鏈霉素的藥物種類和濃度界限也有值得討論之處。WHO和國際防癆和肺部疾病聯(lián)合會公報最初規(guī)定的鏈霉素比例法藥敏試驗應用的藥粉為雙氫硫酸鏈霉素，耐藥濃度界限為4 μg/ml。而目前因雙氫硫酸鏈霉素不良反應大，臨床已經放棄使用，制藥企業(yè)已經不再生產，導致實驗室難以獲得雙氫硫酸鏈霉素藥物純粉，絕大多數實驗室只能以硫酸鏈霉素替代，這可能會導致鏈霉素假耐藥增多。比例法鏈霉素藥物濃度界限是否恢復到10 μg/ml，以及鏈霉素和乙胺丁醇實驗室間質量評價符合率不高的原因值得進一步研究[26]。

第四，許多臨床醫(yī)生和預防人員認為藥敏試驗方法由實驗室專家確定即可，這種觀點忽略了藥敏試驗的實際意義，不利于耐藥檢測方法的建立和評估。在臨床治療和流行病學調查中涉及的耐藥，則是指WHO規(guī)定的耐藥標準，即“明顯不同于未接觸藥物的野生菌株，治療反應性下降”。而對于實驗室人員，只要細菌能在含藥培養(yǎng)基上生長，即認為是實驗室耐藥。兩者的差異及藥敏試驗耗時較長的特點，導致藥敏試驗實際應用價值降低。

第五，針對藥物敏感性檢測的方法目前多集中于分子生物學的快速檢測方法和液體培養(yǎng)基法，如文獻所言，對耐藥結核病的研究多注重于流行病學數據，對測定方法的基礎性研究很少[27-30]。作為基礎的傳統(tǒng)固體培養(yǎng)基藥敏試驗方法仍有諸多問題沒有解決。

綜上所述，有必要進一步研究我國現(xiàn)有的耐藥性檢測方法與臨床治療、基因突變的相關性，確定耐藥濃度界限，將耐藥性檢測與“治療反應性下降”相關聯(lián)，提高實驗室結果對臨床治療結果的預示作用，更好地為結核病患者服務。

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(本文編輯：李敬文)

Review of the criteria on drug susceptibility test ofMycobacteriumtuberculosisin China

JIANGGuang-lu,HUANGHai-rong.

TuberculosisClinicalLaboratory,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China

HUANGHai-rong,Email:huanghairong@tb123.org

The epidemic situation of drug-resistant tuberculosis in China is still severe．The phenotypic drug susceptibility testing ofMycobacteriumtuberculosisplays an important role in diagnosis of drug-resistant tuberculosis. A lot of differences between absolute concentration method and proportion method of domestic guideline of labora-tory testing of tuberculosis cause confusion in treatment and drug-resistance monitoring. It is necessary to know the development of drug-resistant test in China, as it is helpful to standardize the detection method. This paper reviews the history of criterion of drug susceptibility test on tuberculosis in China, summarizes problems and puts forward some suggestions, in order to provide useful information for optimization drug susceptibility test.

Mycobacteriumtuberculosis； Tuberculosis, multidrug-resistant； Microbial sensitivity tests； Reference standards

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.09.002

101149 首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院結核病臨床實驗室

黃海榮，Email: huanghairong@tb123.org

2016-07-11)