陳　麗，劉　明，劉　勇，張德秀

?

·實(shí)驗(yàn)研究·

骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6對過氧化氫造成的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

陳麗1，劉明2，劉勇3，張德秀1

Protective effect of bone morphogenetic protein 6 on RPE cells injury caused by H2O2

Citation:Chen L, Liu M, Liu Y,etal. Study of the protective effect of bone morphogenetic protein 6 on RPE cells injury caused by H2O2.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(1):37-40

摘要

目的：觀察骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6(bone morphogenetic protein，BMP-6)對過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)作用的人視網(wǎng)膜色素上皮株ARPE-19細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、增殖以及凋亡的影響。

方法：常規(guī)培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞，分為正常對照組、75μmol/L H2O2及150ng/mL BMP-6、75μmol/L H2O2+150ng/mL BMP-6環(huán)境中培養(yǎng)3、6、9、12h后，MTT比色法檢測細(xì)胞的活性；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的周期及凋亡變化。

結(jié)果：H2O2作用組的細(xì)胞活性隨著作用時(shí)間的延長逐步降低；而BMP-6+H2O2組的細(xì)胞活性則較H2O2組高，在3h及6h時(shí)兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；細(xì)胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)：H2O2培養(yǎng)6h后，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞發(fā)生脫落，而添加BMP-6后細(xì)胞脫落及凋亡均要明顯減少。

結(jié)論:BMP-6可以一定程度上保護(hù)視網(wǎng)膜色素上皮受到氧化應(yīng)激的損傷。

關(guān)鍵詞：骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6；氧化應(yīng)激；年齡相關(guān)性黃斑變性；過氧化氫

引用：陳麗，劉明，劉勇，等.骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6對過氧化氫造成的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用.國際眼科雜志2016;16(1):37-40

0引言

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是一項(xiàng)進(jìn)行性地?fù)p傷中央視力的疾病，可以導(dǎo)致光感受器細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮的變性，進(jìn)而導(dǎo)致脈絡(luò)膜新生血管突破Bruch’s膜[1]。大量研究結(jié)果提示，氧化應(yīng)激是AMD發(fā)生和發(fā)展的一個(gè)重要的促進(jìn)因素[2]。在AMD患者中，視網(wǎng)膜中鐵的聚集可以加劇它的病程[3]。已有研究證實(shí)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6(bone morphogenetic protein-6，BMP-6)是系統(tǒng)性鐵的主要調(diào)節(jié)因子[4]。BMP-6可否保護(hù)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelial cells，RPE)使其免受氧化應(yīng)激的損傷鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步研究BMP-6對RPE細(xì)胞的抗氧化作用，探討B(tài)MP-6用于防治AMD的可能性。

1材料和方法

1.1材料人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE細(xì)胞株購自美國ATCC公司)，DMEM培養(yǎng)基(美國Sigma)，胎牛血清(FBS，美國Hyclone，USA)，胰蛋白酶(Amersco，USA)，過氧化氫(遠(yuǎn)大過氧化物有限公司，上海)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6(BMP-6，美國Sigma)；流式細(xì)胞儀(型號FACS Calibur，BD公司,USA)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)：取出裝有ARPE-19細(xì)胞株的細(xì)胞凍存管，迅速置于37℃水浴中解凍，將細(xì)胞懸液移入離心管中，加入5mL含15%新生牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，1 000r/min離心5min，棄上清，加入5mL含15%新生牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，接種入50mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，將其置于5% CO2，95%空氣、濕度90%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后觀察細(xì)胞情況。取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，常規(guī)DMEM培養(yǎng)，次日貼壁生長后更換為無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，分為：(1)正常對照組；(2)H2O275μmol/L組；(3)H2O275μmol/L+BMP-6作用組(150ng/mL)；(4)BMP-6(150ng/mL)作用組；各作用0、3、6、9、12h。

1.2.2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察RPE細(xì)胞消化、傳代后以1×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中，靜置培養(yǎng)24h后吸棄上清，更換為無血清培養(yǎng)液，同步化處理24h，分為正常對照組、H2O2組、BMP-6組及H2O2+BMP-6組作用3、6、9、12h。在倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，并采集圖像。

1.2.3 MTT法測定細(xì)胞的活性將RPE細(xì)胞以5×104個(gè)/mL細(xì)胞密度接種于96孔板中，次日貼壁生長后按照實(shí)驗(yàn)分組加入試劑：(1)氧化損傷組加入H2O275μmol/L，(2)H2O275μmol/L+BMP-6(150ng/mL)作用組，(3)BMP-6(150ng/mL)作用組，各作用0、3、6、9、12h。呈色：每孔加MTT溶液(5mg/mL，用pH=7.4的PBS配)20μL。繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150μL DMSO，置于搖床上低速振蕩使結(jié)晶物充分融解。比色：選擇492nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.4流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞的周期及凋亡變化分組：(1) 正常對照組；(2)氧化損傷組加入H2O275μmol/L；(3)H2O275μmol/L+BMP-6(150ng/mL)作用組；(4)BMP-6(150ng/mL)作用組，作用12h。收集細(xì)胞，1 000r/min離心5min，棄上清液。用PBS溶液清洗3次，用70%乙醇混勻固定，4℃過夜，PBS再清洗細(xì)胞 30min，在離心管中留1mL PBS，仔細(xì)打散細(xì)胞團(tuán)，加入RNase A 5μL(1mg/mL)，37℃溫浴30min，加入500μL含50μg/mL溴化乙錠的PBS，室溫避光30min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布情況及凋亡情況，獲取軟件：CellQuest Pro；分析軟件：Modifit LT。重復(fù)3次。

圖1H2O2及H2O2+ BMP-6不同作用時(shí)間組細(xì)胞活性的比較aP<0.05vs同時(shí)間點(diǎn)H2O2組;bP<0.01vs同組0h。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞活性分析MTT法檢查結(jié)果(圖1)顯示，在作用3、6、12h時(shí)方差齊性檢驗(yàn)均為P>0.05，表示具有方差齊性，所以多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，在作用3、6、12h時(shí)組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)：在3h和6h時(shí)H2O2與H2O2+BMP-6比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在12h時(shí)H2O2與H2O2+BMP-6比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.928>0.05)。在9h作用組行方差齊性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)P=0.01<0.05，表示不具有方差齊性，所以多重比較采用Tamhane’s檢驗(yàn)，結(jié)果在作用9h時(shí)組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在作用9h時(shí)H2O2組與H2O2+BMP-6組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.946>0.05)。

2.2 RPE細(xì)胞形態(tài)的變化倒置相差顯微鏡下觀察，正常的人RPE傳代后4h開始呈貼壁生長，貼壁良好的細(xì)胞呈紡錘形或梭形，細(xì)胞內(nèi)顆粒分布均勻(圖2A)。可見，H2O2作用組，RPE細(xì)胞的細(xì)胞體皺縮、變圓，呈空泡狀，部分細(xì)胞脫壁(圖2H6)。而單純BMP-6作用組可看到細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞密度變大(圖2B6)。而添加BMP-6的H2O2作用組可以看到細(xì)胞體皺縮，變圓空泡現(xiàn)象較單純H2O2組有所改善(圖2HB6)。

2.3流式細(xì)胞分析細(xì)胞周期及凋亡的結(jié)果各組作用12h后，用流式細(xì)胞分析細(xì)胞周期及凋亡。由表1及圖3可以看出，正常對照組、H2O2組、BMP-6組、H2O2+BMP-6組作用12h時(shí)凋亡率分別為4.83%、32.63%、4.86%、23.67%；進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)具有方差齊性，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)：BMP-6組與正常對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.97>0.05)；其余兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05)?？梢钥闯?，H2O2可以加劇視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的凋亡，單獨(dú)添加BMP-6作用后凋亡率與正常對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而BMP-6則可以對抗H2O2促進(jìn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的凋亡作用。細(xì)胞周期的分析中我們可以看出，H2O2組G2+S期的細(xì)胞比例明顯增加，而G1期的比例明顯降低。

3討論

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是與年齡相關(guān)的視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜中心區(qū)域(黃斑區(qū))的光感受器-視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)-Bruch膜-脈絡(luò)膜毛細(xì)血管復(fù)合體的進(jìn)展性病變，可導(dǎo)致中心視力的喪失。AMD嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，由于中心視力喪失，患者生活不能自理，同時(shí)造成沉重的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前AMD的病理過程并不是很清楚，認(rèn)為與氧化應(yīng)激及炎癥有關(guān)。視網(wǎng)膜組織由于耗氧量高、富含多不飽和脂肪酸、且暴露于光照，成為氧化應(yīng)激的高度易感部位[5]。

圖2RPE細(xì)胞形態(tài)的變化(×200)A：正常對照；H3：H2O2組3h；H6：H2O2組6h；B3：BMP-6組3h；B6：BMP-6組6h；HB3：H2O2+ BMP-6組3h；HB6：H2O2+ BMP-6組6h。

圖3培養(yǎng)12h后各組細(xì)胞周期及凋亡的檢測結(jié)果A：對照組；B：H2O2組；C：BMP-6組；D：H2O2+BMP-6組。

表1各組作用12h后RPE 細(xì)胞周期各時(shí)期比例的變化

，%，n=3)

aP<0.05vs正常對照組。

過氧化氫是一種重要的活性氧，外源性過氧化氫極易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)過渡金屬存在時(shí)通過Fenton反應(yīng)，形成高活性的自由基，如單態(tài)氧、羥自由基等，進(jìn)一步造成細(xì)胞損傷。因其操作簡單，容易控制，現(xiàn)廣泛用于體外模擬細(xì)胞的過氧化損傷實(shí)驗(yàn)[6]。鐵是一種潛在的氧化劑，過量的鐵可以啟動Fenton反應(yīng)，催化H2O2形成羥自由基，進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、DNA鍵斷裂、細(xì)胞降解，導(dǎo)致組織破壞[7]。

在視網(wǎng)膜中，光傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)中涉及多種鐵相關(guān)蛋白。RPE65，在RPE中表達(dá)的與鐵相關(guān)的蛋白，在視覺循環(huán)中負(fù)責(zé)所有酯轉(zhuǎn)化為11順式視黃醇。光感受器細(xì)胞不斷地流出及合成它們的外節(jié)盤,因而很大程度依賴于脂肪酸去飽和酶(一種膜脂質(zhì)合成所必須的鐵相關(guān)蛋白)。同其他細(xì)胞一樣，視網(wǎng)膜細(xì)胞容易受到過量鐵導(dǎo)致的氧化應(yīng)激的損害。過量鐵可以損害RPE的吞噬作用。鐵是鳥苷酸合成cGMP(光傳導(dǎo)途徑的二級信使)所必須的。長期暴露于光線，光致氧化作用在視網(wǎng)膜中產(chǎn)生了超過正常水平的反應(yīng)氧化產(chǎn)物。二十二碳六烯酸，這種組織豐富的多元不飽和脂肪酸，易受脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的影響在自由基之前，進(jìn)而影響視網(wǎng)膜的功能?；谶@些原因，鐵平衡的調(diào)節(jié)在視網(wǎng)膜中有很重要的作用，鐵平衡的破壞將產(chǎn)生嚴(yán)重的生物及臨床后果[8]。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetie proteins，BMPs)是一組具有類似結(jié)構(gòu)的高度保守的功能蛋白，它們最初是作為能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)骨和軟骨形成的因子為人們所認(rèn)識的。但隨著分子生物學(xué)研究的深入，對BMPs家族成員的研究日益深入和擴(kuò)展，已發(fā)現(xiàn)BMPs廣泛分布于人體多種組織和細(xì)胞，對靶細(xì)胞的生長、分化以及凋亡具有調(diào)控作用，在機(jī)體胚胎生長發(fā)育、創(chuàng)傷愈合、機(jī)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過程中起重要作用[9]。有研究表明，BMPs在眼的發(fā)育和眼疾病中發(fā)揮著重要作用，參與視覺系統(tǒng)發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段。BMP-6具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)及功能特征，其作用復(fù)雜，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)多種代謝過程，不僅在維持生理功能上具有重要作用，而且還介導(dǎo)了許多疾病的發(fā)生，因此對BMP-6的研究越來越受人們的重視[10]。

新近研究發(fā)現(xiàn)，BMP-6是影響機(jī)體鐵代謝的重要調(diào)節(jié)因素。這一發(fā)現(xiàn)不僅豐富了機(jī)體鐵代謝及其調(diào)控的理論知識，還可嘗試運(yùn)用BMP-6的調(diào)控作用治療鐵代謝相關(guān)疾病[11]。在鼠眼內(nèi)進(jìn)行BMP-6蛋白注射，可以上調(diào)鐵調(diào)素進(jìn)而改變視網(wǎng)膜鐵的水平。BMP-6敲除小鼠會產(chǎn)生劑量依賴性的視網(wǎng)膜內(nèi)鐵的積聚和變性[12]。尸檢發(fā)現(xiàn)，早期黃斑變性患者視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中BMP-6的水平明顯下降。早期AMD中BMP-6水平的降低可以導(dǎo)致在AMD中鐵離子的集聚[13]。Majda等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)及體外，氧化應(yīng)激可以下調(diào)BMP-6 mRNA的表達(dá)。運(yùn)用H2O2作用于體外培養(yǎng)的RPE后，BMP-6 mRNA的表達(dá)明顯下降。

既然氧化應(yīng)激導(dǎo)致的BMP-6的下調(diào)已被證實(shí)與AMD有關(guān)。那么體外添加BMP-6可否保護(hù)RPE細(xì)胞受到氧化應(yīng)激的損傷，我們實(shí)驗(yàn)觀察75μmol/L H2O2對體外培養(yǎng)的RPE的增殖抑制作用及促進(jìn)凋亡的作用，且這種作用具有時(shí)間依賴性。單純150ng/mL BMP-6可以呈時(shí)間依賴性地對RPE細(xì)胞有輕微的促增殖作用。添加BMP-6可以阻止H2O2對RPE細(xì)胞的氧化損傷。在作用3h和6h時(shí)，H2O2+BMP-6組與H2O2組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以看出，BMP-6早期是可以阻止H2O2對RPE細(xì)胞的氧化損傷。在隨后的細(xì)胞形態(tài)觀察中發(fā)現(xiàn)，作用3h和6h時(shí)，H2O2組細(xì)胞明顯皺縮及脫落，H2O2+BMP-6組細(xì)胞脫落及皺縮現(xiàn)象有所減少。在流式細(xì)胞儀檢查中發(fā)現(xiàn)，作用3h和6h時(shí)，H2O2+BMP-6組的凋亡率均較H2O2有所降低。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，75μmol/L H2O2可以縮短G1期時(shí)相，加快細(xì)胞周期的進(jìn)程。既往研究氧化應(yīng)激對細(xì)胞周期的影響表明，根據(jù)細(xì)胞類型的不同、細(xì)胞培養(yǎng)條件的不同及氧化應(yīng)激水平的不同，細(xì)胞周期的阻滯是多向的[15]：有的是阻滯于G1期，有的是G2期[16]。我們研究發(fā)現(xiàn)，H2O2可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，可以使細(xì)胞阻滯于G2+S期，而BMP-6可以逆轉(zhuǎn)這種阻滯。

綜上所述，體外培養(yǎng)的RPE細(xì)胞中，BMP-6對RPE細(xì)胞無明顯的毒性作用，可以輕微促進(jìn)RPE細(xì)胞的增殖。BMP-6可以一定程度上保護(hù)視網(wǎng)膜色素上皮受到氧化應(yīng)激的損傷，但是它的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步的探討研究，本研究為探討治療AMD新方法奠定了一定的基礎(chǔ)。

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Li Chen1， Ming Liu2，Yong Liu3， De-Xiu Zhang1

Foundation item:Research and Development Program of Science and Technology of Shaanxi Province of China (No.2012K16-11-01)

1Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China;2Department of Ophthalmology, Xi’an No.1 Hospital, Xi’an 710001，Shaanxi Province, China;3Institute of Neurobiology, Xi’an Jiaotong University Health Science Center, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China

Correspondence to:Yong Liu. Institute of Neurobiology, Xi’an Jiaotong University Health Science Center, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China. liuy5599@mail.xjtu.edu.cn

Received：2015-07-04Accepted：2015-12-15

Abstract

?AIM:To investigate the effect of bone morphogenetic protein 6(BMP-6) on cellular morphology, proliferation and apoptosis of retinal pigment epithelial cells(ARPE-19) incubated in hydrogen peroxide(H2O2).

?METHODS:ARPE-19 cells were cultured conventionally and divided into four groups. One group was untreated as blank group, the other three groups were incubated in 75μm/L H2O2, 150ng/mLBMP-6 or75μm/L H2O2+150ng/mL BMP-6. All the groups were incubated for 3h, 6h, 9h and 12h. We tested the cell viabilitity by MTT. We used flow cytometry to test the cell cycle and cell apoptosis.

?RESULTS:H2O2significantly decreased the cell activity in time-dependent manner. The activity of cells with BMP-6+H2O2was higher H2O2group, and the differences between the two groups at 3h and 6h were significant (P<0.05). The observation on cellular morphology showed that the cell number decreased and the cell detachment after 6h incubated with H2O2， while the cells with BMP-6 were less cell detachment and apoptosis.

?CONCLUSION:BMP-6 has protective effects on RPE cells from oxidative stress in certain extent.

KEYWORDS:?bone morphogenetic protein 6;oxidative stress；age-related macular degeneration;hydrogen peroxide

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.1.09

收稿日期：2015-07-04 修回日期： 2015-12-15

通訊作者：劉勇，博士，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：腦血管病基礎(chǔ)研究與神經(jīng)干細(xì)胞應(yīng)用基礎(chǔ)研究.liuy5599@mail.xjtu.edu.cn

作者簡介：陳麗，女，在讀博士研究生，研究方向：視網(wǎng)膜疾病的基礎(chǔ)研究。

基金項(xiàng)目：中國陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012K16-11-01)
作者單位：`1(710061)中國陜西省西安市，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科；`2(710001)中國陜西省西安市第一醫(yī)院眼科；`3(710061)中國陜西省西安市，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物研究所