何榮軍，趙月鈞，趙瑞娜，孫培龍

(浙江工業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 杭州 310014)

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?？庖呋钚远嗵堑拈W式提取工藝研究

何榮軍，趙月鈞，趙瑞娜，孫培龍

(浙江工業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 杭州 310014)

摘要：在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析法對(duì)星蟲愛氏?？嗵?SAP)的閃式提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并測(cè)定了?？嗵堑捏w外免疫活性.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：海葵多糖的最佳提取工藝為剪切時(shí)間7 min，剪切溫度40 ℃，液料比為10 mL/g，在此條件下?？偺堑寐蕿?.29%，接近理論多糖得率.提取的?？嗵墙?jīng)30%，60%，80%乙醇醇沉，木瓜蛋白酶水解，Sevag試劑除蛋白后，所得組分均能顯著提高THP-1細(xì)胞的TNF-α表達(dá)水平，30%醇沉部分(SAP30)的作用最為明顯.

關(guān)鍵詞：星蟲愛氏?？?；多糖；閃式提?。幻庖哒{(diào)節(jié)

海洋的特殊環(huán)境，促成海洋動(dòng)物多糖結(jié)構(gòu)與功能的多樣性.目前已有大量研究結(jié)果表明：鮑魚和海膽等海洋動(dòng)物多糖具有增強(qiáng)免疫的生物活性[1-3].星蟲愛氏?？?Edwardsiasipunculoides)屬于?？?Sea anemone)的一種，沿海居民又稱它為“涂蒜”，主要分布在我國(guó)的渤海、黃海和南海等海域，營(yíng)埋棲息生活[4].有記載海葵具有抗腫瘤[5-6]，降壓、抗菌、鎮(zhèn)痛和中樞神經(jīng)抑制[7]等作用.目前國(guó)內(nèi)外對(duì)?？难芯恐饕性谄涠舅氐慕Y(jié)構(gòu)及生物活性方面，對(duì)于海葵多糖的研究報(bào)道相對(duì)稀少.鄭淑貞等[8]首次對(duì)生長(zhǎng)于我國(guó)南海西沙群島的斯式花群?？鸝oanthusstephensoni化學(xué)成分進(jìn)行了研究，同時(shí)他們研究發(fā)現(xiàn)該類?？刑崛〉亩嗵蔷哂忻黠@的降壓作用[9].

閃式提取是一種新型的天然產(chǎn)物提取技術(shù)，原料在高速剪切力和攪拌力作用下粉碎成細(xì)小顆粒，同時(shí)利用局部負(fù)壓滲透作用讓原料中的有效成分迅速擴(kuò)散到溶劑中，在最短時(shí)間內(nèi)達(dá)到溶解平衡[10].筆者主要從多糖的閃式提取工藝及其體外免疫作用的角度去研究海葵，為開發(fā)利用海葵資源提供一定的研究基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)中的星蟲愛氏?？烧憬_(tái)州東經(jīng)水產(chǎn)有限公司贈(zèng)送.

RPMI 1640培養(yǎng)液、PBS和0.25%胰酶(吉諾生物醫(yī)藥有限公司)，二甲基亞砜(上海澤衡生物技術(shù)有限公司)，無(wú)支原體胎牛血清(浙江生物技術(shù)有限公司)，THP-1細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫(kù))，TNF-α ELISA酶聯(lián)免疫試劑盒(上海源葉生物技術(shù)有限公司)，3 U/mg木瓜蛋白酶(Sigma公司)，葡萄糖、苯酚、濃硫酸、正丁醇和氯仿均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

1.2主要儀器設(shè)備

GF-1型高速分散器(江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)，DG5033A型酶聯(lián)免疫測(cè)定儀(南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司).

1.3?？嗵堑奶崛?/p>

先將新鮮?？羲椋缓笥媒M織剪切機(jī)將其打成勻漿液.取10 g?？麆驖{液加入一定量的水，放入GF-1型高速分散器中進(jìn)行閃式剪切提取，提取液離心收集上清液，減壓濃縮后用95%乙醇分級(jí)醇沉.取沉淀，用水溶解，加入粗多糖質(zhì)量0.5%木瓜蛋白酶，55 ℃水解2 h，沸水浴5 min滅酶，再加入糖液三分之一體積的Sevag試劑，按照V(正丁醇)∶V(氯仿)=1∶4除蛋白，取水相真空冷凍干燥后得?？嗵?SAP).

1.4總糖得率測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定響應(yīng)面中海葵總糖得率[11-13]，即

總糖得率=

1.5?？嗵菍?duì)THP-1細(xì)胞產(chǎn)TNF-α的影響

將THP-1以1×105個(gè)/孔加入96孔板中，加質(zhì)量濃度為62.5，125，250，500 μg/mL的待測(cè)多糖溶液，平行三組，培養(yǎng)48 h后，吸取細(xì)胞培養(yǎng)液上清100 μL，用ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α.

2結(jié)果與討論

2.1閃式提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1時(shí)間對(duì)總糖得率的影響

取10 g組織勻漿后的勻漿液，加入100 mL蒸餾水，離心速率為10 000 r/min，20 ℃剪切提取4，5，6，7，8 min，提取液經(jīng)離心取上清液測(cè)總糖得率.圖1(a)顯示時(shí)間對(duì)總糖得率影響較大.隨著時(shí)間的增加，總糖得率也隨之增加，但當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到7 min后總糖得率趨于平緩.

2.1.2溫度對(duì)總糖得率的影響

取10 g組織勻漿后的勻漿液，加入100 mL蒸餾水，離心速率10 000 r/min，分別在20，30，40，50，60 ℃剪切提取8 min，提取液經(jīng)離心取上清液采用苯酚硫酸法測(cè)定吸光值，計(jì)算得到總糖得率.圖1(b)顯示總糖得率與提取溫度呈正相關(guān)關(guān)系.當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，總糖得率與60 ℃時(shí)的基本相同，因此，選擇40，50，60 ℃為響應(yīng)面因素溫度的三個(gè)水平.

圖1　提取條件對(duì)總糖得率的影響Fig.1　Effect of condition on extraction yield of polysaccharides

2.1.3液料比對(duì)總糖得率的影響

取10 g組織勻漿后的勻漿液，分別加入20，40，60，80，100 mL蒸餾水，離心速率為10 000 r/min，在20 ℃剪切提取8 min，提取液經(jīng)離心取上清液采用苯酚硫酸法測(cè)定吸光值，計(jì)算得到總糖得率.圖1(c)顯示的是隨著液料比的增加，總糖得率增加，當(dāng)液料比達(dá)到6 mL/g時(shí)，總糖得率增加趨勢(shì)有所變緩.

2.2閃式提取響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合計(jì)原理，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取提取時(shí)間、提取溫度和液料比三個(gè)重要影響因素，以總糖得率為響應(yīng)值Y，采用表1所示的試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.

表1　響應(yīng)面分析因素與水平

對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得?？嗵堑寐蔣對(duì)于因素A，B，C的回歸方程為

Y=8.10+0.25X1+0.055X2+0.57X3+

0.068X1X2+0.79X1X3-0.83X2X3-

1.48X1X1-0.79X2X2-0.77X3X3

(1)

利用F檢驗(yàn)和p值對(duì)該模型的方差分析見表3.由表3中各模型的p值可知：式(1)中一次項(xiàng)時(shí)間和料液比為極顯著因素，溫度為不顯著因素；式(1)中大部分二次項(xiàng)極顯著；表明?？嗵菍?duì)各影響因素不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系.F值檢驗(yàn)表明：該模型具有較高的F值(F=260.64)和較低的p值(p<0.000 1)，表明這個(gè)模型極顯著.因此可以用該數(shù)學(xué)模型對(duì)閃式提取?？嗵菍?shí)驗(yàn)結(jié)果及最優(yōu)條件進(jìn)行分析和預(yù)測(cè).

表2　響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3　回歸方程各項(xiàng)的方差分析表

注：1)p<0.01為極顯著**.

圖2為閃式提取?？嗵琼憫?yīng)面曲面圖.曲面圖越對(duì)稱兩因素之間的交互作用越不明顯[14].由此可知：在閃式提取?？嗵窃囼?yàn)中，時(shí)間和溫度的交互作用不明顯，而時(shí)間與液料比，溫度和液料比之間的交互作用十分明顯.為了進(jìn)一步確定最佳值，根據(jù)對(duì)響應(yīng)面圖的分析及Design-Expert軟件的優(yōu)化分析，得到最佳提取條件：提取時(shí)間為7.28 min，溫度為45.52 ℃，液料比為9.36 mL/g，?？嗵抢碚摰寐蕿?.30%.為檢驗(yàn)該法的可靠性，考慮到實(shí)際操作的便利，將最佳工藝參數(shù)修正為：提取時(shí)間7 min，溫度為45 ℃，液料比為9 mL/g，進(jìn)行多糖提取的驗(yàn)證試驗(yàn)，經(jīng)3次平行試驗(yàn)，實(shí)際得率平均值為8.29%.可見實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好，說(shuō)明該模型能較好地模擬和預(yù)測(cè)海葵多糖得率.

圖2　各因素對(duì)總糖的交互影響曲面圖Fig.2　Responsive surfaces of the interactive effects on polysaccharides

2.3?？嗵菍?duì)THP-1細(xì)胞產(chǎn)TNF-α的影響

采用苯酚-硫酸法對(duì)SAP30，SAP60和SAP80三個(gè)組分進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果顯示SAP30組分總糖含量最高為95.61%，其次為SAP80組分88.27%，最后是SAP60組分87.06%.

TNF-α是由巨噬細(xì)胞在外來(lái)抗原刺激下產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，可直接殺死大部分腫瘤細(xì)胞，同時(shí)具有促進(jìn)傷口愈合、血管生成等功效[15].采用62.5，125，250，500 μg/mL等的不同質(zhì)量濃度與不同組分的?？嗵谴碳HP-1細(xì)胞來(lái)觀察細(xì)TNF-α細(xì)胞因子的表達(dá).圖3顯示?？嗵悄艽龠M(jìn)THP-1細(xì)胞分泌TNF-α的能力，具有劑量依賴性.且在相同質(zhì)量濃度下，SAP30組分TNF-α細(xì)胞因子表達(dá)的量明顯高于其它兩個(gè)組分.

圖3　?？嗵菍?duì)THP-1細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的影響Fig.3　Effect of SAP on THP 1 cells to produce the influence of TNF

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用閃式提取?？嗵堑姆椒ㄅc傳統(tǒng)的熱水浸提法相比，不僅大大縮短了多糖的提取時(shí)間，在多糖得率方面因閃式提取方法可在常溫或溫度不高的水環(huán)境中提取多糖，可避免提取過程中?？嗵桥c其蛋白質(zhì)等發(fā)生美拉德反應(yīng)，從而提高的?？嗵堑牡寐?通過響應(yīng)面優(yōu)化研究，得到海葵多糖提取最優(yōu)工藝參數(shù)為提取時(shí)間7 min，溫度為45 ℃，液料比為9 mL/g，在此條件下?？嗵堑寐蕿?.29%.多糖作為重要的生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，對(duì)機(jī)體免疫具有重要的調(diào)節(jié)作用.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：從?？刑崛〉牟煌M分多糖均能夠促進(jìn)THP-1細(xì)胞分泌抗腫瘤壞死因子TNF-α，其中SAP30組分對(duì)于促進(jìn)TNF-α的表達(dá)效果明顯優(yōu)于其他兩個(gè)組分.海葵多糖的免疫活性與其單糖組成、分子量大小和結(jié)構(gòu)等都有密切關(guān)系，為闡明?？嗵堑拿庖哒{(diào)節(jié)機(jī)制，在今后的工作中還需對(duì)其構(gòu)效進(jìn)行深入研究.

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(責(zé)任編輯：陳石平)

Study on optimizing homogenate extraction processing and immune

activityinvitroof polysaccharide from sea anemone

HE Rongjun, ZHAO Yuejun, ZHAO Ruina, SUN Peilong

(Ocean College, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014，China)

Abstract:Based on the single factor tests, the response surface methodology (RSM) was used for optimizing homogenate extraction processing of polysaccharide from Edwardsia sipunculoides (SAP). TNF-α of THP-1 cell stimulated by different concentractions of SAP30, SAP60 and SAP80 was detected by ELISA method. The results showed that the optimum extraction condition of polysaccharide from Edwardsia sipunculoides was as follows: 7 min homogenate extraction time, extraction temperature 40 ℃, and ratio of material to liquid 1∶10.Under the conditions, the extracting yield reached 8.29%. The study on immune activity in vitro showed that SAP could promote the concentration of TNF-α of THP-1 cell, while the effect of SAP30 was the most significant.

Keywords:Edwardsia sipunculoides; polysaccharide; homogenate extraction; immune activity

文章編號(hào)：1006-4303(2015)04-0389-04

中圖分類號(hào)：Q819

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

作者簡(jiǎn)介：何榮軍(1978—),男，浙江龍泉人，講師，主要從事食品化學(xué)的研究，E-mail:hrjun@zjut.edu.cn.

基金項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LY12H28007)

收稿日期：2015-01-26