黃海英，陳尚明，趙建美(南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通226001)

新生大鼠缺血缺氧性腦損傷組織中HAX-1、Caspase-3、bcl-2表達(dá)變化及意義

黃海英，陳尚明，趙建美
(南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通226001)

摘要:目的觀察新生大鼠缺氧缺血性腦損傷( HIBD)組織中血細(xì)胞特異蛋白1相關(guān)蛋白X-1( HAX-1)、Caspase-3、bcl-2的表達(dá)，并探討其意義。方法128只大鼠隨機分為觀察組和對照組各64只，觀察組采用Rice法制備HIBD模型，對照組僅分離左側(cè)頸總動脈不結(jié)扎。分別于造模后0、2、6、12、24、48、72 h斷頭取腦，采用Western blot法檢測大腦皮層HAX-1、Caspase-3、bcl-2蛋白。結(jié)果與對照組同時點比較，觀察組HAX-1于造模后6、12、18、48 h表達(dá)升高，Caspase-3于造模后6、12、18 h表達(dá)升高，bcl-2于造模后2、6、12 h表達(dá)升高，P均＜0.05;觀察組造模后12、18 h的HAX-1的表達(dá)水平均高于造模后6 h，P均＜0.05。結(jié)論新生大鼠HIBD模型大腦皮層中存在HAX-1、Caspase-3、bcl-2高表達(dá)，三者共同參與了HIBD的發(fā)生、發(fā)展。

關(guān)鍵詞:缺血缺氧性腦損傷;血細(xì)胞特異蛋白1相關(guān)蛋白X-1;凋亡蛋白; B淋巴細(xì)胞瘤/白血病2基因

新生兒缺血缺氧性腦損傷( HIBD)是導(dǎo)致兒童神經(jīng)系統(tǒng)損傷和殘疾的最常見原因［1，2］，其發(fā)生機制目前尚未明確。血細(xì)胞特異蛋白1相關(guān)蛋白X-1( HAX-1)是一種抗凋亡基因［3］，研究發(fā)現(xiàn)其在腦出血、創(chuàng)傷性腦外傷［4］、多囊腎［5］、系統(tǒng)性紅斑狼瘡［6］、銀屑?。?］、中性粒細(xì)胞缺乏癥［8］等疾病的發(fā)生、進(jìn)展過程中起重要作用。但是，目前對于HAX-1在HIBD腦損傷中的作用尚未見報道。2012年9月～2013年2月，我們觀察了HIBD大鼠大腦皮層中HAX-1、Caspase-3、bcl-2的表達(dá)，旨在探討三者在HIBD發(fā)生、發(fā)展中的作用?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1動物與試劑動物: 7日齡清潔級SD大鼠128只，雌雄不限，體質(zhì)量12～18 g，由南通大學(xué)實驗動物中心提供。試劑: ITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG (北京中杉)，Cys標(biāo)記的兔抗小鼠IgG (北京中杉)，HAX-1單克隆抗體( BD)，DAB試劑盒( DAKO)，ELC化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，3-磷酸甘油醛脫氫酶( GAPDH，Sigma)，Caspase-3、bcl-2試劑( R＆D)。

1.2動物分組與造模處理128只大鼠隨機分為觀察組和對照組各64只，觀察組采用Rice方法［9］制備HIBD模型。造模后2.5 h采用Longa評分法［10］行神經(jīng)行為缺損評分，2～3分視為造模成功。死亡12只，最終造模成功52只。對照組僅分離左側(cè)頸總動脈，不做結(jié)扎處理，其余處理同觀察組;死亡11只，最終觀察53只。

1.3大腦皮層HAX-1、Caspase-3、bcl-2蛋白表達(dá)檢測兩組分別于造模后0、2、6、12、24、48、72 h各處死7～8只，斷頭取腦。在解剖顯微鏡下剝脫腦膜，取出海馬CA1區(qū)對應(yīng)大腦皮層，連續(xù)冠狀切片，片厚4 mm。采用Western blot法檢測大腦皮層HAX-1、Caspase-3、bcl-2蛋白，實驗步驟嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。以GAPDH作為內(nèi)參，采用Quantity-one軟件計算各樣品蛋白表達(dá)水平，進(jìn)行相對表達(dá)量分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，采用單因素方差分析和q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

兩組各時點大腦皮層HAX-1、Caspase-3、bcl-2蛋白相對表達(dá)量比較，見表1。

3　討論

據(jù)統(tǒng)計，HIBD存活者25%～30%可能有不同程度的后遺癥，嚴(yán)重影響患兒的生活質(zhì)量［11，12］。目前，HIBD的發(fā)病機制仍未明確，但神經(jīng)元細(xì)胞的破壞和凋亡是當(dāng)前研究的熱點［13］。

HAX-1基因位于染色體1q21.3，是新近發(fā)現(xiàn)的抗凋亡基因之一，其結(jié)構(gòu)與bcl-2蛋白家族的BH1、BH2結(jié)構(gòu)域相似。bcl-2家族是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的一

表1　兩組各時點大腦皮層HAX-1、Caspase-3 及bcl-2蛋白相對表達(dá)量比較(±s)

表1　兩組各時點大腦皮層HAX-1、Caspase-3 及bcl-2蛋白相對表達(dá)量比較(±s)

注:與對照組同時點比較，#P＜0.05;與觀察組造模后6 h比較，▲P＜0.05。

組別　n HAX-1　 Caspase-3　bcl-2觀察組52造模后0 h　9.60±0.82　 5.68±0.49　 28.20±2.68造模后2 h　9.70±0.44　 5.72±0.64　 39.20±2.20#造模后6 h　13.30±1.01#18.60±1.88#18.18±1.68#造模后12 h　 16.40±1.45#▲19.44±2.05#17.66±1.77#造模后18 h　 26.80±2.20#▲14.22±1.87#23.33±2.14造模后48 h　 13.88±1.76#　6.11±1.05　 25.44±2.22造模后72 h　 13.21±1.25#　6.25±1.14　 29.88±2.55對照組　53造模后0 h　9.87±0.82　 5.70±0.49　 24.20±2.04造模后2 h　9.96±0.78　 5.66±0.54　 25.20±2.20造模后6 h　10.10±0.84　 5.83±0.88　 23.18±1.98造模后12 h　 10.33±0.85　 6.22±1.05　 25.66±1.77造模后18 h　 10.66±0.92　 6.08±1.14　 26.33±2.14造模后48 h　9.55±0.80　 6.01±1.15　 20.44±2.22造模后72 h　9.60±0.72　 6.34±1.24　 21.88±2.55

種重要蛋白，bax能夠促進(jìn)凋亡［14］，同時bcl-2能阻止凋亡的發(fā)生。HAX-1可通過抑制bax蛋白的激活，達(dá)到抗凋亡的作用，進(jìn)而抑制Caspase-3的活性，起到抗凋亡的作用［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，HAX-1與bcl-2的表達(dá)高峰存在時間差異，可能與殘存神經(jīng)元增加HAX-1表達(dá)有關(guān)。HAX-1通過其抗凋亡的作用，延緩神經(jīng)元凋亡;而殘存的神經(jīng)元亦通過增加HAX-1表達(dá)，從而減輕或緩和幼鼠HIBD造成的腦損傷，兩者可能存在正反饋調(diào)節(jié)機制。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組大腦皮層HAX-1和Caspase-3的表達(dá)趨勢均為先升高后降低，其中HAX-1表達(dá)高峰在造模后18 h，而Caspase-3的表達(dá)高峰在造模后12 h。其原因可能為缺血缺氧條件下，神經(jīng)元的凋亡和抗凋亡共同存在。細(xì)胞凋亡過程中Caspase-3能剪切HAX-1，下調(diào)HAX-1的表達(dá);同時HAX-1亦可抑制Caspase-3的活化，兩者存在反饋性調(diào)節(jié)機制［9］，且損傷12 h之前，Caspase-3占主導(dǎo)性優(yōu)勢;而損傷18 h后HAX-1的主導(dǎo)優(yōu)勢越來越強。

綜上所述，新生大鼠HIBD大腦皮層中存在HAX-1、Caspase-3、bcl-2異常表達(dá)，三者共同參與了HIBD的發(fā)生、發(fā)展。

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收稿日期:( 2014-12-05)

通信作者:趙建美

文章編號:1002-266X( 2015)30-0030-02

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R364.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.30.011