常晨城 齊利枝 閆素梅生 冉 趙艷麗（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018）

β－羥丁酸對奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)乳脂肪合成及其相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

常晨城 齊利枝 閆素梅?生 冉 趙艷麗
（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018）

摘 要：本試驗(yàn)主要研究了不同濃度的β－羥丁酸（BHBA）對奶牛乳腺上皮細(xì)胞（BMECs）活力、甘油三酯（TAG）含量、脂滴形成以及乳脂肪合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。將傳至第3代的BMECs懸液（1×105個(gè)／孔）接種于細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM／F12培養(yǎng)液，于37℃的5%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。再將培養(yǎng)48 h的BMECs隨機(jī)分配到6個(gè)組，各組向培養(yǎng)孔中加入含不同濃度BHBA的DMEM／F12培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中的FBS用1 g／L無脂肪酸的牛血清白蛋白（BSA）代替，并使反應(yīng)體系中BHBA的最終濃度分別為0（對照）、0．58、1．16、2．32、4．64和9．28 mmol／L。置于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。試驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著BHBA濃度的增加，BMECs活力［（相對增殖率（RGR）］呈顯著的二次曲線增加（P＝0．041），其中BMECs活力以0．58～4．64 mmol／L BHBA組較高，9．28 mmol／L BHBA組較低；低濃度（0．58～2．32 mmol／L）的BHBA可促進(jìn)BMECs內(nèi)脂滴的形成，而較高濃度（4．64～9．28 mmol／L）的BHBA對脂滴形成的促進(jìn)作用減弱；BHBA與TAG含量及乳脂肪合成相關(guān)基因脂肪酸合成酶（FASN）、乙酰輔酶A羧化酶α（ACACA）、硬脂酰輔酶A去飽和酶（SCD）、脂肪酸結(jié)合蛋白3（FABP3）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）和分化抗原簇36（CD36）的相對表達(dá)量均無顯著的一次線性或二次曲線關(guān)系（P＞0．05）。綜上，BHBA對BMECs活力的促進(jìn)作用呈顯著的二次曲線增加，即BHBA對BMECs活力呈顯著濃度依賴關(guān)系；BHBA對細(xì)胞內(nèi)乳脂肪的合成有提高的趨勢。

關(guān)鍵詞：β－羥丁酸；乳腺上皮細(xì)胞；乳脂肪合成相關(guān)基因；奶牛

乳脂肪是構(gòu)成牛奶營養(yǎng)品質(zhì)的主要基礎(chǔ)物質(zhì)之一，與牛奶的質(zhì)量密切相關(guān)；促進(jìn)乳腺內(nèi)乳脂肪的合成、改進(jìn)乳脂肪組成是改善牛奶品質(zhì)的重要措施之一。因此，深入研究乳成分前體物（milk component precursor，MCP）對研究乳脂肪合成的調(diào)節(jié)機(jī)理、改進(jìn)牛奶品質(zhì)、保證優(yōu)質(zhì)牛奶生產(chǎn)具有重要的理論與指導(dǎo)意義。短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFA）乙酸和β－羥丁酸（β?hydroxybu?tyric acid，BHBA）是奶牛乳腺合成乳脂肪前體物（milk fat precursor，MFP），乳腺中約50%的脂肪酸來源于SCFA在奶牛乳腺上皮細(xì)胞（bovine mam?mary epithelial cells，BMECs）內(nèi)的從頭合成，主要包括中短鏈脂肪酸（short and medium chain fatty acids，SMCFA）（C4∶0～C14∶0）及C16∶0。許多研究均表明，乙酸作為MFP在提高乳脂率、促進(jìn)乳脂肪合成方面起著重要作用。陳杰等［1］的研究報(bào)道，在奶牛飼糧中添加乙酸鈉可使產(chǎn)奶量增加5．58%，乳脂率增加10．58%。乙酸鈉也可稱為“化學(xué)粗飼料”，在飼糧中添加乙酸鈉，可增加瘤胃內(nèi)乙酸比例、降低丙酸比例，從而提高乳脂率和產(chǎn)奶量。也有研究表明，通過陰外動(dòng)脈或瘤胃灌注乙酸可提高乳脂肪和乳蛋白含量。Purdie等［2］研究表明，奶牛陰外動(dòng)脈灌注乙酸可顯著增加乳脂率。孫滿吉等［3］在奶山羊陰外動(dòng)脈灌注乙酸顯著提高了乳脂率，并使乳腺攝取的MFP能轉(zhuǎn)化為乳脂肪的效率提高了1．02%～2．04%。Maxin等［4］的研究表明，瘤胃灌注乙酸使得乳脂率增加了6．5%，而且改變了乳脂肪組成。齊利枝等［5］研究了不同濃度的乙酸對BMECs中乳脂肪合成的影響，結(jié)果指出乙酸對BMECs內(nèi)脂滴形成及甘油三酯（triglyc?erides，TAG）的積累有顯著的促進(jìn)作用，同時(shí)指出在乙酸濃度為10～12 mmol／L時(shí)，能較好的促進(jìn)過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）基因的表達(dá)。BHBA作為重要的MPF之一，主要由瘤胃上皮細(xì)胞吸收的丁酸轉(zhuǎn)化而來，然而，關(guān)于BHBA對乳脂肪合成方面的影響研究卻十分有限，結(jié)果也不盡一致。白鴿等［6］在奶牛肝細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加不同濃度的BHBA，結(jié)果表明，高濃度的BH?BA可以抑制肝臟脂肪氧化和合成，從而影響MFP的供應(yīng)，進(jìn)一步影響乳脂肪的合成?？讘c洋［7］利用體外法研究了不同濃度的丁酸鈉對BMECs胞外TAG含量的影響，結(jié)果表明，隨著丁酸鈉濃度的增加，TAG含量顯著增加，同時(shí)與乳脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)量也有升高的趨勢。然而，Yoneza?wa等［8］的研究發(fā)現(xiàn)，丁酸（1～10 mmol／L）以劑量依賴模式影響B(tài)MECs的TAG積累和脂滴形成，丁酸可能抑制脂肪的合成，促進(jìn)BMECs內(nèi)的β氧化。鑒于此，本試驗(yàn)以BMECs為模型，研究不同濃度的BHBA對細(xì)胞活力、乳脂肪合成及乳脂肪合成相關(guān)基因的相對表達(dá)量的影響，進(jìn)一步明確BHBA對乳脂肪合成的促進(jìn)作用及其可能機(jī)理。

1　材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

DMEM／FA12培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、催乳素、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子、胰蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）均購自美國的Gibco公司，氫化可的松、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）和β－羥丁酸鈉均購自美國的Sigma公司，磷酸鹽緩沖溶液（PBS，HyClone，美國），無脂肪酸牛血清白蛋白（BSA，Equitech?Bio，美國），RNAprep pure Cell／Bacteria Kit［天根生化科技（北京）有限公司］，PrimeScript RT Master Mix（TaKa?Ra，大連）和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa，大連）。

BMECs采用膠原酶消化法獲得。取健康荷斯坦奶牛乳腺組織，分離去除組織外層于深處取約1 cm3的組織塊若干，放入預(yù)冷的PBS中。帶入超凈臺用PBS將組織塊洗凈后，再剪去組織塊表層并將組織塊剪成糊狀。加入0．5%膠原酶Ⅱ（GIB?CO，美國）溶液于37℃的5%二氧化碳（CO2）條件下消化1 h，每隔20 min輕輕搖晃離心管。消化液用孔徑80目的細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞濾液，800×g離心5 min，棄上清。加入BMECs培養(yǎng)液，吹打均勻，轉(zhuǎn)入25 cm2培養(yǎng)瓶中，于37℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞的生長情況，待細(xì)胞生長至80%～90%融合度時(shí)，根據(jù)BMECs與成纖維細(xì)胞對胰蛋白酶消化敏感性不同，純化BMECs并進(jìn)行傳代。本試驗(yàn)采用第3代傳代細(xì)胞進(jìn)行研究。將傳至第3代的BMECs懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔加入含10%FBS的DMEM／F12培養(yǎng)液，于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

1．2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將培養(yǎng)48 h的BMECs培養(yǎng)孔隨機(jī)分為6個(gè)組，每個(gè)組4個(gè)重復(fù)。每孔加入含不同濃度BHBA 的DMEM／F12培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中的FBS用1 g／L無脂肪酸的BSA代替，并使反應(yīng)體系中BHBA（以β－羥丁酸鈉的形式進(jìn)行添加）的最終濃度分別為0（對照）、0．58、1．16、2．32、4．64和9．28 mmol／L，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1．3 測試指標(biāo)與方法

1．3．1 細(xì)胞活力

細(xì)胞活力的檢測采用MTT比色法［9］，以細(xì)胞相對增殖率（relative growth rate，RGR）表示。收集第3代的BMECs，用含10%FBS的DMEM／F12培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮液以1×104個(gè)／孔接種于96孔培養(yǎng)板（Corning，3599），置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h后吸出各孔內(nèi)培養(yǎng)液，添加含不同濃度BHBA的DMEM／F12誘導(dǎo)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；在培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入20 μL MTT（5 mg／mL）；4 h后棄上清液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Synergy H4 Bio Tek，美國）檢測490 nm波長下各培養(yǎng)孔的吸光度（OD490 nm）值。

RGR（%）＝（試驗(yàn)組OD490 nm／

對照組OD490 nm）×100。

1．3．2 脂滴的形成與TAG含量

BMECs內(nèi)脂滴的形成與TAG含量采用油紅O染色法，其中TAG含量的測定根據(jù)Ramírez?Zacarías等［10］的方法進(jìn)行。將細(xì)胞懸浮液（1× 105個(gè)／孔）接種于24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)48 h后棄掉培養(yǎng)液，用PBS漂洗2次，每孔加入0．2 mL 4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞1 h；PBS漂洗2次，用0．5 mL油紅O工作液浸染2 h，用PBS溶液漂洗直至干凈，顯微鏡（Olympuse IX71，日本）下觀察拍照；培養(yǎng)板置于32℃培養(yǎng)箱內(nèi)將多余的水分蒸發(fā)，加入0．3 mL異丙醇萃取，然后將染液用移液槍吸出，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于510 nm波長處測吸光度（OD510 nm）值，以O(shè)D510 nm值代表TAG含量。每個(gè)組3個(gè)重復(fù)。

1．3．3 乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)乳脂肪合成相關(guān)基因的相對表達(dá)量

BMECs內(nèi)乳脂肪合成的相關(guān)基因包括：脂肪酸合成酶（FASN）、乙酰輔酶A羧化酶α（ACA?CA）、硬脂酰輔酶A去飽和酶（SCD）、分化抗原簇36（CD 3 6）、脂肪酸結(jié)合蛋白3（FABP 3）和PPARG，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT?PCR）法檢測。將每孔1×105個(gè)細(xì)胞懸浮液接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)48 h后提取RNA。細(xì)胞總RNA的提取采用RNAprep Pure Cell／Bacteria Kit試劑盒，RNA的完整性和純度用2%的凝膠電泳在電泳儀（Bio?Rad）上進(jìn)行檢測。反轉(zhuǎn)錄采用Pri?meScript RT Master Mix試劑盒，反應(yīng)體系為10 μL。RNA反轉(zhuǎn)錄后用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行RT?PCR，反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10 μL，上、下游引物各0．4 μL，cDNA模板2 μL和dH2O 7．2 μL。選用管家基因磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參基因。引物列表見表1。RT?PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5．0℃30 s；95．0℃30 s，退火溫度30 s，72．0℃20 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃7 min。熔解曲線程序?yàn)椋?0～95℃，每6 s升高0．5℃，共51個(gè)循環(huán)。每個(gè)組6個(gè)重復(fù)。采用2－△△Ct法進(jìn)行相對定量數(shù)據(jù)分析。

1．4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9．0軟件的回歸統(tǒng)計(jì)程序，對各項(xiàng)測試指標(biāo)的BHBA處理劑量效應(yīng)進(jìn)行一次線性和二次曲線回歸分析，P＜0．05表示差異顯著。

表1　引物序列及參數(shù)Table 1 Primer sequences and parameters

2　結(jié) 果

2．1 BHBA對BMECs活力的影響

表2結(jié)果表明，0．58～4．64 mmol／L BHBA組RGR均高于對照組，而當(dāng)BHBA濃度增加到9．28 mmol／L時(shí)，RGR降低，并低于對照組?；貧w分析結(jié)果表明，RGR隨著BHBA濃度的增加呈顯著的二次曲線變化（P＝0．041，R2＝0．881 4），二者呈顯著的劑量依賴關(guān)系。

表2　BHBA對BMECs活力（相對增殖率）的影響Table 2 Effect of BHBA on viability（RGR）of BMECs　%

2．2 BHBA對BMECs內(nèi)TAG含量和脂滴形成的影響

表3結(jié)果表明，盡管從數(shù)值上看，低濃度的BHBA（0．58～2．32 mmol／L）組TAG含量較高，高濃度的BHBA（4．64～9．28 mmol／L）組呈降低趨勢，但經(jīng)回歸分析檢驗(yàn)，隨著BHBA濃度增加，BMECs內(nèi)TAG含量沒有顯著的一次線性或二次曲線變化（P＞0．05）。由圖1的脂滴形成結(jié)果可以直觀地看出，低濃度（0．58～2．32 mmol／L）的BHBA對BMECs內(nèi)脂滴的形成有一定的促進(jìn)作用，而高濃度（4．64～9．28 mmol／L）的BHBA對脂滴的形成促進(jìn)效果減弱。

表3　BHBA對BMECs內(nèi)TAG含量的影響Table 3 Effect of BHBA on TAG content in BMECs

圖1　BHBA對BMECs內(nèi)脂滴形成的影響Fig．1 Effect of BHBA on lipid droplet formation in BMECs（400×）

2．3 BHBA對BMECs乳脂肪相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

如表4所示，0．58～9．28 mmol／L BHBA組的FASN、ACACA、FABP3和PPARG基因相對表達(dá)量均在數(shù)值上高于對照組，其中FASN和FABP3基因相對表達(dá)量以1．16～2．32 mmol／L BHBA組的較高，ACACA和SCD基因相對表達(dá)量以0．58～ 1．16 mmol／L BHBA組的較高，PPARG基因相對表達(dá)量以4．64～9．28 mmol／L BHBA組的較高。所有BHBA組的CD36基因相對表達(dá)量均低于對照組。然而，經(jīng)回歸分析檢驗(yàn)，F(xiàn)ASN、ACACA、SCD、CD36、FABP3和PPARG的基因表達(dá)量隨著BHBA濃度增加的均沒有顯著的一次線性或二次曲線變化（P＞0．05）。

表4　BHBA對BMECs乳脂肪相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響Table 4 Effects of BHBA on therelative expression of genes involved in milk fat synthesis in BMECs

3　討 論

細(xì)胞活力是用來反映細(xì)胞存活和增殖的指標(biāo)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BHBA作為乳脂肪酸內(nèi)源合成的前體物對BMECs活力的調(diào)節(jié)作用呈顯著的濃度依賴關(guān)系，RGR隨著BHBA濃度的增加呈顯著的二次曲線增加，即低濃度的BHBA（0．58～4．64 mmol／L）可促進(jìn)BMECs活力，而高濃度（9．28 mmol／L）則表現(xiàn)出抑制作用。目前關(guān)于SCFA對BMECs活力的研究報(bào)道極少，其機(jī)理還需要進(jìn)一步探討。

乳脂肪的主要成分是TAG，它在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的表面合成，在細(xì)胞質(zhì)中以脂滴的形式積累，不同大小的脂滴被質(zhì)膜包裹后從細(xì)胞分泌出去［14］。因此，BMECs內(nèi)脂滴的形成和TAG含量直接反映了BMECs內(nèi)乳脂肪的合成情況，與乳脂率密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，在BMECs培養(yǎng)液中添加不同濃度的BHBA，對細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成有一定促進(jìn)效果，對TAG的積累盡管無顯著的影響，但從總體趨勢看，低濃度（0．58～2．32 mmol／L）的BH?BA對TAG的積累有一定的促進(jìn)作用，而高濃度（4．64～9．28 mmol／L）的BHBA有一定抑制效果。目前，關(guān)于BHBA對乳脂肪合成的影響及其機(jī)理研究報(bào)道甚少，結(jié)果也不盡一致。本研究結(jié)果提示，BHBA對BMECs內(nèi)乳脂肪的合成有一定促進(jìn)作用，且促進(jìn)效果與BHBA的濃度有關(guān)。

FASN和ACACA是奶牛乳腺中參與脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵酶［15］?？讘c洋［7］在BMECs培養(yǎng)液中添加丁酸（0～1．25 mmol／L），顯著增加了細(xì)胞外TAG的含量，上調(diào)了FASN和ACACA的基因表達(dá)。然而，Yonezawa等［8］的研究發(fā)現(xiàn)，1～10 mmol／L的丁酸以劑量依賴模式影響B(tài)MECs的TAG積累和脂滴形成，10 mmol／L的丁酸促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)TAG的積累，降低了乙酰輔酶A羧化酶的活性，但沒有形成脂滴；提示丁酸可能抑制脂肪的合成，促進(jìn)BMECs內(nèi)的β－氧化；結(jié)果也指出，細(xì)胞內(nèi)TAG的積累可能直接或間接地與BMECs的分化有關(guān)。本試驗(yàn)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BHBA對BMECs的FASN和ACACA基因相對表達(dá)量影響經(jīng)回歸分析差異不顯著，即BHBA作為MFP，其濃度和與從頭合成有關(guān)的FASN和ACACA基因相對表達(dá)量無顯著的一次線性或二次曲線的關(guān)系。SCD是單不飽和脂肪酸合成的主要酶，由于瘤胃氫化作用，乳腺攝取的脂肪酸中只有少量是飽和脂肪酸。SCD位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，它能在14烷酰－、16烷酰－和18烷酰－輔酶A的C9位上形成雙鍵，但其主要底物是棕櫚酰輔酶A和硬脂酰輔酶A［16］。本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，經(jīng)回歸分析檢驗(yàn)，BHBA濃度與SCD基因相對表達(dá)量無顯著的一次線性或二次曲線的關(guān)系。目前關(guān)于BHBA對SCD基因相對表達(dá)量的影響尚未見報(bào)道，確切的結(jié)果還有待于進(jìn)一步的探討。

FABP3和CD36是奶牛乳腺中2種主要的長鏈脂肪酸（long chain fatty acids，LCFA）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在奶牛乳腺中FABP3和CD36基因的共表達(dá)提示這2種蛋白存在相近的功能關(guān)系［17］。FABP3參與細(xì)胞內(nèi)LCFA的轉(zhuǎn)運(yùn)，CD36主要將脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入乳腺細(xì)胞，二者與BMECs對LCFA的攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。PPAR在奶牛的乳脂肪合成方面起重要調(diào)節(jié)作用［15，18］，對調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化有一定作用［19］。已發(fā)現(xiàn)的PPAR有3種亞型：PPARα、PPARβ／δ和PPARγ，各亞型的組織分布不同［20］。然而，目前關(guān)于丁酸對FABP3、CD36和PPAR基因相對表達(dá)量的研究極少。Yonezawa等［8］研究表明，BMECs培養(yǎng)液中分別添加10 mmol／L乙酸、丁酸或辛酸，均可顯著上調(diào)細(xì)胞中CD36 mRNA表達(dá)量，但對PPARγ的蛋白質(zhì)表達(dá)的下調(diào)作用不顯著。然而，本試驗(yàn)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BHBA濃度對FABP3、CD36和PPARγ基因相對表達(dá)量的影響結(jié)果經(jīng)回歸分析檢驗(yàn)差異均不顯著。造成這些結(jié)果不一致的原因尚不清楚，目前相關(guān)的研究報(bào)道也很少，值得進(jìn)一步探討。

綜上所述，本試驗(yàn)主要研究了BHBA對BMECs內(nèi)乳脂肪合成的促進(jìn)作用，結(jié)果得出低濃度（0．58～2．32 mmol／L）的BHBA可促進(jìn)脂滴的形成，高濃度（4．64～9．28 mmol／L）的促進(jìn)效果減弱。在此基礎(chǔ)上又從乳脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)的角度探討了其可能的影響機(jī)理，結(jié)果顯示，0．58～9．28 mmol／L BHBA的對FASN、ACACA、SCD、FABP3、PPARγ和CD36基因的相對表達(dá)量均無顯著一次線性或二次曲線的調(diào)節(jié)作用。由此可見，BHBA對BMECs內(nèi)乳脂肪合成的促進(jìn)作用是否與乳脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)生改變有關(guān)，還需要進(jìn)一步探討。

神經(jīng)內(nèi)分泌因素對乳脂肪和乳蛋白含量具有重要的調(diào)控作用。生長激素和催乳素可以調(diào)控奶牛乳脂肪和乳蛋白前體物的生成、攝取和利用。而乳脂肪和乳蛋白前體物也可以通過直接或間接作用調(diào)控牛垂體組織泌乳相關(guān)激素的合成和分泌。王建發(fā)［21］的研究指出，BHBA不僅能作為能量物質(zhì)直接參與機(jī)體能量代謝調(diào)控，還可作為中樞信號物質(zhì)影響下丘腦能量穩(wěn)態(tài)和激素分泌功能；BHBA可引起奶牛腺垂體細(xì)胞的生長激素和催乳素等內(nèi)分泌激素的分泌量減少，進(jìn)而影響乳蛋白與乳脂肪等乳成分的合成。因此，BHBA對乳脂肪合成的影響可能與神經(jīng)內(nèi)分泌有關(guān)，但確切的研究有待進(jìn)一步探討。

4　結(jié) 論

BHBA對BMECs活力的促進(jìn)效果呈顯著的二次曲線增加，即BHBA對BMECs活力呈濃度依賴關(guān)系；BHBA對細(xì)胞內(nèi)乳脂肪的合成有提高的趨勢。

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（編輯 陳 燕）

Effects of β?Hydroxybutyric Acid on Relative Expression Levels of Genes Related to Milk Fat Synthesis in Bovine Mammary Epithelial Cells

CHANG Chencheng QI Lizhi YAN Sumei?SHENG Ran ZHAO Yanli
（College of Animal Science，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018，China）

?Corresponding author，professor，E?mail：yansmimau＠163．com

Abstract：This study was conducted to determine the effects of β?hydroxybutyric acid（BHBA）on cell viabili?ty，triacylglycerol（TAG）content，lipid droplet formation and relative expression levels of genes related to milk fat synthesis in bovine mammary epithelial cells（BMECs）．The 3th passage cells were plated 1×105cells／well in culture plates and DMEM／F12 medium containing 10%fetal bovine serum（FBS）was added to each well，then the plates were maintained in an incubator with 5%CO2at 37℃．After 48 h，cells were ran?domly divided into 6 groups and cultured in DMEM／F12 medium containing different concentrations of BH?BA，F(xiàn)BS in medium was replaced with 1 g／L fatty acid?free bovine serum albumin（BSA）．The final concen?trations of BHBA in reaction systems were 0（control），0．58，1．16，2．32，4．64，9．28 mmol／L，respectively．Continuous incubation in an incubator with 5%CO2at 37℃for 48 h．The results showed that BMECs prolifer?ation［relative growth rate（RGR）］was significantly quadratic increased with BHBA concentration increasing （P＝0．041），and BMECs proliferation of 0．58 to 4．64 mmol／L BHAB groups was high，but 9．28 mmol／L BHBA group was low．BHBA at low concentration（0．58 to 2．32 mmol／L）promoted lipid droplet formation，and the promoting effect of BHBA at high concentration（4．64 to 9．28 mmol／L）was weakened．No significant linear and quadratic relationships were found between BHBA concentration and TAG content（P＞0．05）．No significant linear and quadratic relationships were found between BHBA concentration and relative expression levels of genes related to milk fat synthesis（fatty acid synthetase，acetyl?CoA carboxylase α，stearyl coenzyme A desaturase，fatty acid binding protein 3，peroxisome proliferator?activated receptor γ and cluster of differenti?ation 36）（P＞0．05）．In conclusion，BMECs proliferation significantly quadratic increase with BHBA concen?tration increasing，namely BMECs proliferation has significant concentration?dependent relationship with BHBA concentration，and the milk fat synthesis has a improve trend by BHBA concentration．［Chinese Journal of An?imal Nutrition，2015，27（1）：196?203］

Key words：β?hydroxybutyric acid；mammary epithelial cells；genes related to milk fat synthesis；dairy cows

作者簡介：常晨城（1989—），男，內(nèi)蒙古包頭人，碩士研究生，從事反芻動(dòng)物營養(yǎng)的研究。E?mail：changchencheng8112＠163．com

基金項(xiàng)目：奶業(yè)“973計(jì)劃”（2011CB100800）

收稿日期：2014－07－11

doi：10．3969／j．issn．1006?267x．2015．01．024

文章編號：1006?267X（2015）01?0196?08

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

中圖分類號：S823．9＋1；S852．2

通信作者：?閆素梅，教授，博士生導(dǎo)師，E?mail：yansmimau＠163．com