岳　超，張文婷，高　杰，黃琴偉，施　貝，郭增喜*

(1.浙江中醫(yī)藥大學，杭州　310053；2.浙江省食品藥品檢驗研究院，杭州　310004)

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SPE技術(shù)在風濕骨痛片麻黃含量測定中的應用

岳超1，張文婷2，高杰1，黃琴偉2，施貝2，郭增喜2*

(1.浙江中醫(yī)藥大學，杭州310053；2.浙江省食品藥品檢驗研究院，杭州310004)

摘要：目的采用SPE-HPLC聯(lián)用技術(shù)測定風濕骨痛片麻黃中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量。方法采用Oasis MCX-SPE陽離子固相萃取小柱對樣品進行前處理，Welch XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱，以乙腈-0.1 mL·L-1磷酸(用三乙胺調(diào)pH值至3.0)(5∶95)為流動相等度洗脫，流速1.0 mL·min-1，檢測波長207 nm，柱溫30 ℃。結(jié)果該實驗條件下，鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿分離度好。鹽酸麻黃堿進樣量在22.99～1 150 ng、鹽酸偽麻黃堿進樣量在14.60～730.2 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，鹽酸麻黃堿平均回收率為100.8%(RSD=2.8%)，鹽酸偽麻黃堿平均回收率為98.6%(RSD=2.4%)。結(jié)論該方法簡便、專屬性好，能有效消除復方中其他干擾，可用于風濕骨痛片中麻黃的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：風濕骨痛片；鹽酸麻黃堿；鹽酸偽麻黃堿；SPE-HPLC；含量測定

風濕骨痛片具有溫經(jīng)散寒、通絡止痛之功，用于寒濕閉阻經(jīng)絡所致的痹病，癥見腰脊疼痛、四肢關(guān)節(jié)冷痛。制劑由制川烏、制草烏、紅花、甘草、木瓜、烏梅、麻黃組成，制劑中麻黃發(fā)汗宣痹?，F(xiàn)代藥理研究表明，麻黃堿可興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通過選擇性激動受體而拮抗高K+去極化引起的大鼠膈肌麻痹[1]，配伍君藥烏頭可以增強散濕止痛之功。鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿是麻黃的主要成分，二者均為腎上腺素類藥物，具有使外周血管收縮、血壓升高、心跳加快等作用，對高血壓、冠心病患者產(chǎn)生不良影響[2-3]，是國家規(guī)定需要嚴格控制的毒、麻類成分。目前測定鹽酸麻黃堿的常見方法有滴定法、薄層掃描法、高效液相色譜法等，依據(jù)目前研究報道可見，最為常用的測定方法為HPLC法[4-6]。從現(xiàn)有文獻報道中可見，鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿在色譜中均為末端紫外吸收，且風濕骨痛片制劑成分復雜，制劑中同極性成分及輔料對麻黃含量測定的干擾較大，使其含量測定較為困難。目前固相萃取(SPE)技術(shù)越來越多地應用于中藥質(zhì)量控制[7]，固相萃取技術(shù)可以選擇性地凈化和富集待測的某些組分，與傳統(tǒng)的液液萃取相比，SPE技術(shù)在組分繁雜、分離純化和成分分析難度較大的中成藥質(zhì)量控制中更有優(yōu)勢。綜上所述，實驗采用SPE-HPLC聯(lián)用技術(shù)，有效地消除了制劑中其他成分的干擾，并優(yōu)化測定方法，改善其靈敏度和專屬性，準確地測定麻黃中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量，為風濕骨痛片的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1260系列高效液相色譜儀(G1312B 1260四元泵，G1329B 1260自動進樣儀，G1316A 1260柱溫箱，G4212B 1260DAD檢測器，Chemstation色譜工作站)；PA2251電子分析天平(德國賽多利斯)；4020P超聲波清洗器(韓國JAC公司)。

1.2試藥鹽酸麻黃堿對照品(批號：171241-201007，質(zhì)量分數(shù)99.7%)和鹽酸偽麻黃堿對照品(批號171237-201208，質(zhì)量分數(shù)99.9%)均由中國藥品生物制品檢定所提供；乙腈為色譜純；水為MILIQ水；其他試劑均為分析純。10批風濕骨痛片樣品由合肥迪爾醫(yī)藥生物工程有限公司和安徽精方藥業(yè)股份有限公司提供；缺麻黃樣品由合肥迪爾醫(yī)藥生物工程有限公司提供。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件Welch XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱，以乙腈-0.1 mL·L-1磷酸(用三乙胺調(diào)pH值至3.0)(5∶95)為流動相等度洗脫，流速1.0 m·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長為207 nm，進樣10 μL，理論板數(shù)按鹽酸麻黃堿峰計算應不低于4 000。

2.2對照品溶液的制備取鹽酸麻黃堿對照品、鹽酸偽麻黃堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含22.99和14.60 μg的混合對照品溶液。

2.3供試品溶液的制備取本品20片，精密稱定，研細，取2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率400 W，頻率40 kHz)40 min,并時時振搖，放冷，稱定質(zhì)量，用0.1 mol·L-1的鹽酸溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，精密量取上清液10 mL，加在SPE柱上(以混合型陽離子交換反相吸附劑為填充劑，150或200 mg，容量為6 mL，預先依次用乙腈、水各6 mL淋洗，備用)，依次以水3 mL、氨溶液(5→100)5 mL、水5 mL、甲醇5 mL、乙腈5 mL洗脫，待洗脫液流盡后，放置5 min，用乙腈-濃氨試液(90∶10)混合溶液10 mL洗脫，收集洗脫液，置于40 ℃下減壓回收至干，加入流動相3 mL使完全溶解，精密吸取1 mL，置于10 mL量瓶中，定容至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.4線性關(guān)系考察分別精密吸取2.2項下對照品混合溶液1，2，5，10，15，30和50 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以色譜峰面積(Y)對進樣量(X)進行回歸，計算回歸方程。鹽酸麻黃堿的線性方程為Y=2.304 14X+6.059 8(r=1.000 0)；鹽酸偽麻黃堿的線性方程為Y=2.378 4X-0.058 5(r=1.000 0)。結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿在進樣量22.99～1 150 ng范圍內(nèi)，鹽酸偽麻黃堿在進樣量14.60～730.2 ng范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系。

2.5缺味實驗取缺麻黃陰性樣品和風濕骨痛片樣品(批號130602)，按照2.3項下方法制備，并按照2.1項下色譜條件測定，缺麻黃樣品溶液在鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對照品峰處均未出現(xiàn)色譜峰。結(jié)果表明，該方法專屬性良好。見圖1。

圖1HPLC圖

A.混合對照品；B.供試品溶液；C.陰性樣品；1.鹽酸麻黃堿；2.鹽酸偽麻黃堿

Fig.1 HPLC chromatograms

A.control substance；B.sample；C.negative sample；1.ephedrine hydrochloride；2.pseudoephedrine hydrochloride

2.6精密度實驗精密吸取2.2項下對照品混合溶液連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，鹽酸麻黃堿峰面積的RSD為1.1%，鹽酸偽麻黃堿峰面積的RSD為0.9%，結(jié)果表明，儀器進樣精密度良好。

2.7重復性實驗分別取供試品(批號130602)6份，按照2.3項下制備方法制備，并按照2.1項下色譜條件測定，結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿平均含量為0.814 mg·g-1(RSD=0.8%)，鹽酸偽麻黃堿平均含量為0.323 mg·g-1(RSD=2.2%)，結(jié)果表明，該方法重復性良好。

2.8穩(wěn)定性實驗吸取供試品溶液(批號130602)和對照品溶液，分別于0，4，8，12和24 h進樣，結(jié)果顯示，鹽酸麻黃堿峰面積對照品溶液RSD為0.1%，供試品溶液RSD為0.9%；鹽酸偽麻黃堿峰面積對照品溶液RSD為0.7%，供試品溶液RSD為0.9%。結(jié)果表明，供試品溶液和對照品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9加樣回收率實驗精密稱取供試品(批號130602)9份，分別精密加入鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿對照品溶液適量，按照2.3項下制備法制備，并依照2.1項下方法測定，結(jié)果見表1。鹽酸麻黃堿平均回收率為100.8%(RSD=2.8%)，鹽酸偽麻黃堿平均回收率為98.6%(RSD=2.4%)。

2.10樣品測定取10批風濕骨痛片樣品，按照2.3項下制備方法制備，并依照2.1項下方法測定，計算含量結(jié)果，見表2。

表1風濕骨痛片麻黃加樣回收實驗結(jié)果

Tab.1 Experiment results of recovery rate of Fengshigutong Tablets

成分取樣量/g原有量/mg加入量/mg測得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%鹽酸麻黃堿1.00980.82200.50591.318498.12100.82.81.01290.82450.50591.3557105.001.00920.82150.50591.313897.311.02100.83111.01171.8688102.571.00120.81501.01171.815598.901.01730.82811.01171.8703103.021.00040.81431.51762.314798.871.00740.82001.51762.327199.311.03010.83851.51762.4119103.67鹽酸偽麻黃堿1.00980.32620.23730.559798.3998.62.41.01290.32720.23730.5664100.811.00920.32600.23730.554996.441.02100.32980.43460.764099.901.00120.32340.43460.7620100.911.01730.32860.43460.744995.791.00040.32310.71191.031399.481.00740.32540.71191.0441100.951.03010.33270.71191.009795.10

表2鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿含量測定結(jié)果

Tab.2 Experiment results of the content determination of ephedrine hydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride

批號鹽酸麻黃堿/mg·片-1鹽酸偽麻黃堿/mg·片-1總量/mg·片-113011040.3050.1120.41713011050.3110.1180.42913011060.3050.1120.41713041020.2970.1100.40813041030.2090.1190.3281004010.3210.1270.4481007010.2190.0950.3141301010.3150.1290.4441306010.3180.1130.4311306020.2940.0990.393

3討論

3.1供試品制備方法的選擇實驗中制劑成分復雜，超聲處理后存在較多弱極性生物堿類成分，會對麻黃類生物堿的含量測定產(chǎn)生較大影響，實驗選擇SPE柱對樣品進行凈化和富集，大大減少雜質(zhì)的影響。實驗對比不同提取方式(超聲，回流)、不同超聲時間(0，20和40 min)、不同取樣量(1.5，2.0和2.5 g)條件下待測成分的含量。結(jié)果表明，超聲、回流提取效果相當，超聲40和60 min提取效率相當，說明40 min時已提取完全，取樣2.0 g溶劑量合適，最終確定最佳供試品提取方法。

3.2實驗耐用性考察實驗選擇Kromasil SB 100 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Welch Material XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)2種色譜柱對樣品進行測定，2種色譜柱所測得的樣品含量偏差在3.0%以內(nèi)，且2種色譜柱都有較好的分離度；實驗分別采用25，30，35和40 ℃的柱溫對樣品進行測定，不同柱溫下均有較好的分離，2種色譜柱所測得的樣品含量RSD在3.0%以內(nèi)。

3.3SPE方案優(yōu)化實驗優(yōu)化了SPE柱前處理、上樣、淋洗、洗脫多個操作及相應溶劑。實驗采用水、甲醇、乙腈淋洗，保證目標成分充分交換和完全洗脫；選擇乙腈-濃氨(9∶1)溶液洗脫，在既保證目標成分完全洗脫的前提下，又可以減少其他弱極性成分的吸附，達到最佳萃取效果。

綜上所述，實驗采用SPE-HPLC聯(lián)合技術(shù)，以陽離子SPE技術(shù)消除相同極性成分干擾，并優(yōu)化了液相條件，使得鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的色譜峰分離度好、靈敏度高，可以準確地測定風濕骨痛片中麻黃的含量，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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Application of SPE on the content determination ofEphedraeherbain Fengshigutong Tablets

YUE Chao1，ZHANG Wenting2，GAO Jie1，HUANG Qinwei2，SHI Bei2，GUO Zengxi2*(1.Zhejiang Medical University，Hangzhou 310053，China；2.Zhejiang Institute for Food and Drug Control，Hangzhou 310004，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method for the content determination of ephedrine hydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride in Fengshigutong Tablets by SPE-HPLC. MethodsSamples were pretreated by Oasis MCX-SPE cation solid phase extraction column and analyzed by HPLC consisting of a Welch XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) column and a mixture of acetonitrile-0.1 mL·L-1H3PO4(adjusting the pH to 3.0 with triethylamine) (5∶95) solution as the mobile phase， flow rate was 1.0 mL·min-1and wavelength was 207 nm. The column temperature was 30 ℃. ResultsThe method showed good linearity in the range of 22.99-1 150 ng and 14.60-730.2 ng. The average recovery of ephedrine hydrochloride was 100.8%(RSD=2.8%)，pseudoephedrine hydrochloride 98.6%(RSD=2.4%). ConclusionThis method can eliminate the negative interference，with good specificity，and can be used for the quality control of Fengshigutong Tablets.

Key words:Fengshigutong Tablets；ephedrine hydrochloride；pseudoephedrine hydrochloride；SPE-HPLC；content determination

收稿日期：(2015-04-27)

通信作者：*郭增喜，男，副主任中藥師

作者簡介：岳超，女，在讀碩士研究生

中圖分類號：R927.2

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)01-0045-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.01.015