劉　可，劉利根

(中國(guó)藥科大學(xué)中藥制劑教研室，南京　210009)

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HPLC-CAD法測(cè)定遠(yuǎn)志藥材中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的含量

劉可，劉利根*

(中國(guó)藥科大學(xué)中藥制劑教研室，南京210009)

摘要：目的建立高效液相-電霧式檢測(cè)器(HPLC-CAD)方法測(cè)定遠(yuǎn)志藥材中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的含量。方法色譜柱為Ultimate XB-C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；柱溫25 ℃；流動(dòng)相為甲醇-0.3 mL·L-1磷酸溶液(60︰40)；流速1 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL；電霧式檢測(cè)器，霧化溫度25 ℃，采集頻率10 Hz。結(jié)果細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷峰面積與質(zhì)量濃度線性回歸方程：Y= 4.295 4X-0.135 8，r =0.999 9( n=6 )，線性范圍為1.0～10.0 mg·mL-1；平均回收率為101.4 %。結(jié)論該方法高效、快速、準(zhǔn)確，可作為藥物及制劑中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的含量測(cè)定方法。

關(guān)鍵詞：遠(yuǎn)志；細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷；HPLC-CAD；含量測(cè)定

遠(yuǎn)志是遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志PolygalatenuifoliaWilld.或卵葉遠(yuǎn)志PolygalasibiricaL.的干燥根[1]。細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷是遠(yuǎn)志皂苷堿水解的唯一產(chǎn)物，是控制遠(yuǎn)志總皂苷含量的指標(biāo)性成分[2]。細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷可以顯著抑制Aβ-淀粉樣蛋白的分泌[3]，且能透過(guò)血腦屏障[4]改善老年記憶障礙小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[5-6]，具有良好的抗老年癡呆作用。

電霧式檢測(cè)器(charged aerosol detection，CAD)是一種新型HPLC檢測(cè)器，靈敏度和重復(fù)性高、動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍寬、操作直觀簡(jiǎn)單[7]，不依賴化學(xué)結(jié)構(gòu)的信號(hào)響應(yīng)一致性，為通用性檢測(cè)器，應(yīng)用于中性、酸性、堿性及兩性物質(zhì)等，特別是無(wú)紫外吸收、非揮發(fā)性或半揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè)[8]。近年來(lái)在各領(lǐng)域中顯示出非凡的能力。本文采用HPLC-CAD方法測(cè)定遠(yuǎn)志藥材中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的含量，建立一種準(zhǔn)確、快速、高效的含量測(cè)定方法，對(duì)遠(yuǎn)志藥材及細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷制劑的測(cè)定具有參考價(jià)值，對(duì)其類(lèi)似化合物的測(cè)定提供了參考依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器UltiMate 3000高效液相色譜儀,電霧式檢測(cè)器，型號(hào)：Corona Ultra(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司) ；主要配置：泵(含內(nèi)置脫氣機(jī))，型號(hào)：HPG-3400；自動(dòng)進(jìn)樣器，型號(hào)：WPS-3000TSL(帶自動(dòng)清洗針功能)；柱溫箱，型號(hào)：TCC-3000。

1.2試藥細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量95.3 %，批號(hào)111849-201303)；生遠(yuǎn)志Ⅰ(購(gòu)于安徽省萬(wàn)生中藥飲片有限公司)，生遠(yuǎn)志Ⅱ(購(gòu)于臨湘市中藥飲片加工廠)，蜜遠(yuǎn)志(購(gòu)于亳州市永剛飲片廠)；甲醇(色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司)；無(wú)水乙醇(分析純，南京化學(xué)試劑有限公司)。

2方法與結(jié)果

2.1檢測(cè)條件HPLC條件：Ultimate XB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.3 mL·L-1磷酸溶液(60∶40)；流速:1 mL·min-1；進(jìn)樣量:10 μL；柱溫：25 ℃；CAD參數(shù)：采集頻率10 Hz；霧化溫度：25 ℃；

霧化氣壓：35 psi。

2.2對(duì)照品溶液的制備取細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含10 mg的溶液，超聲15 min，定容至刻度，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3供試品溶液的制備取遠(yuǎn)志粉末(過(guò)三號(hào)篩)約1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為70 %的甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液25 mL，旋干，殘?jiān)?00 g·L-1的氫氧化鈉溶液50 mL，加熱回流2 h，鹽酸調(diào)pH至4～5，用水飽和的正丁醇萃取3次，每次50 mL，合并正丁醇液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状歼m量溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.4線性關(guān)系考察精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液，以適量的甲醇將其分別稀釋為1.0，2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 mg·mL-1，按照 2. 1項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，以細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷質(zhì)量濃度(X)對(duì)峰面積(Y) 進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:Y=4.295 4X-0.135 8，r=0. 999 9(n=6)。結(jié)果表明，細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷在1.0～10.0 mg·mL-1范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，且線性關(guān)系良好。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取生遠(yuǎn)志Ⅰ6 份，分別制備供試品溶液[9]，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷色譜峰面積，計(jì)算其RSD值為 1.2 %。

2.5.2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取生遠(yuǎn)志Ⅰ供試品溶液，按照 2.1項(xiàng)下色譜條件，每次進(jìn)樣10 μL，分別在0，2，4，8，16和24 h進(jìn)樣分析，測(cè)定細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷色譜峰面積，計(jì)算得其 RSD 值為1.1 %。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3精密度實(shí)驗(yàn)取3.69 mg·mL-1細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對(duì)照品溶液，按照 2. 1項(xiàng)下色譜條件，每次進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷峰面積，計(jì)算得RSD值為 0.5 %。

2.5.4加樣回收率實(shí)驗(yàn)取1.00 mg·mL-1生遠(yuǎn)志Ⅰ供試品溶液5 mL，平行3份，分別精密加入3.8，4.9和6.0 mg細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對(duì)照品，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣分析，測(cè)定細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果回收率分別為100.8 %，100.4 %和100.9 %，平均回收率為100.7 %，RSD值為0.3 %。

2.6樣品測(cè)定取生遠(yuǎn)志Ⅰ、生遠(yuǎn)志Ⅱ和蜜遠(yuǎn)志樣品，按照2.3項(xiàng)下方法，分別制備供試品溶液，按照 2.1項(xiàng)下色譜條件分析測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算生遠(yuǎn)志Ⅰ、生遠(yuǎn)志Ⅱ、蜜遠(yuǎn)志樣品中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示，生遠(yuǎn)志Ⅰ中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.22%；生遠(yuǎn)志Ⅱ中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.22%；蜜遠(yuǎn)志中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.56%。見(jiàn)圖1。

圖1HPLC-CAD圖

A．對(duì)照品；B．生遠(yuǎn)志Ⅰ；C．生遠(yuǎn)志Ⅱ；D．蜜遠(yuǎn)志

Fig.1 HPLC-CAD chromatograms

A.reference substance; B.crudeRadixpolygalaeⅠ; C.crudeRadixpolygalaeⅡ; D.honey processedRadixpolygalae

3討論

CAD檢測(cè)器作為一種新型通用檢測(cè)器，檢測(cè)信號(hào)不依賴被檢測(cè)物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，對(duì)不同結(jié)構(gòu)的化合物有統(tǒng)一的響應(yīng)[10]?，F(xiàn)已應(yīng)用于皂苷、糖、脂質(zhì)和多肽等樣品的檢測(cè)[11]。與紫外和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器相比，CAD檢測(cè)器對(duì)皂苷類(lèi)成分的檢測(cè)分析更加靈敏、準(zhǔn)確和穩(wěn)定[12]。對(duì)于CAD檢測(cè)器，流動(dòng)相中磷酸濃度過(guò)高，會(huì)造成基線噪音增大。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇了0.3 mL·L-1磷酸溶液作為流動(dòng)相。CAD作為質(zhì)量型檢測(cè)器，可以通過(guò)適當(dāng)增大進(jìn)樣體積來(lái)檢測(cè)低濃度樣品，或進(jìn)行柱后有機(jī)相補(bǔ)償，提高化合物的響應(yīng)，降低定量檢出限[13]。本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC-CAD測(cè)定遠(yuǎn)志藥材中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的含量測(cè)定方法。經(jīng)過(guò)線性、穩(wěn)定性、重復(fù)性、精密度和加樣回收等方法學(xué)考察，結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確度高，精密度、重復(fù)性較好，質(zhì)量濃度在1.0～10.0 mg·mL-1范圍內(nèi)，線性相關(guān)較好(r=0.999 9)，可作為藥物及制劑中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的含量測(cè)定方法，對(duì)皂苷類(lèi)化合物及其類(lèi)似化合物的測(cè)定具有參考價(jià)值。

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Determination of tenuifolin inRadixpolygalaeby HPLC-CAD

LIU Ke，LIU Ligen*(Department of Pharmaceutics of Traditional Chinese Medicine，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a high performance liquid chromatographic with charge aerosol detection (HPLC-CAD) method for the determination of tenuifolin in Radix polygalae. Methods Ultimate XB-C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm) was used in the study and the column temperature was 25 ℃，and methanol-0.3mL·L-1phosphoric acid (60︰40) solution as the mobile phase with a flow rate at 1 mL·min-1;the injection volume was 10 μL；CAD:nebulization temperature was 25 ℃ and collection frequency was 10 Hz．ResultsThe equation of linear regression was Y=4.295 4X-0.135 8，r=0. 999 9(n=6)，linear range was 1.0-10.0 mg·mL-1, and the average recovery was 101.4%. ConclusionThe method is accurate，rapid and high sensitive，which can be used in the quantitative determination of tenuifolin in protein pharmaceuticals．

Key words:Radix Polygalae；tenuifolin；HPLC-CAD；content

收稿日期：(2015-08-18)

通信作者：*劉利根，男，副研究員

作者簡(jiǎn)介：劉可，女，在讀碩士研究生

中圖分類(lèi)號(hào)：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)01-0034-03

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.01.011