徐奇超，崔慧芳

(浙江省寧波市藥品檢驗(yàn)所，寧波　315048)

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HPLC法測定痔速寧片中蘆丁與沒食子酸的含量

徐奇超，崔慧芳

(浙江省寧波市藥品檢驗(yàn)所，寧波315048)

摘要：目的建立HPLC法測定痔速寧片中蘆丁與沒食子酸含量的方法。方法采用Thermo Acclaim TM 120 C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇-0.4 mL·L-1磷酸溶液，梯度洗脫；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為257和273 nm；進(jìn)樣量5 μL；柱溫35 ℃。結(jié)果蘆丁與沒食子酸的線性范圍分別為10.54～105.4 μg·mL-1(r=0.999 9，n=6)和51.075～510.75 μg·mL-1(r=0.999 9，n=6)；提取回收率分別為99.2%(RSD=0.7%，n=6)和99.4%(RSD=0.9%，n=6)。結(jié)論該方法簡便、可靠、準(zhǔn)確，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：痔速寧片；蘆??；沒食子酸；HPLC

痔速寧片處方由白蘞、槐花、五倍子、黑豆、豬膽膏組成，能解毒消炎、止血止痛、消腫通便、收縮痔核，用于內(nèi)痔、外痔、混合痔、肛裂等的治療。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)中無含量測定項(xiàng)[1]。目前有多篇關(guān)于采用高效液相色譜法測定蘆丁、沒食子酸含量[2-5]的報(bào)道，但未見采用高效液相色譜法同時(shí)測定蘆丁與沒食子酸的報(bào)道。為了更好地控制痔速寧片的質(zhì)量，筆者建立了高效液相色譜法同時(shí)測定痔速寧片中槐花與五倍子的有效成分蘆丁與沒食子酸含量的方法。

1儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜(LC-20AT四元泵，SPD-M20A二極管陣列檢測器，LC Solution 操作系統(tǒng)，日本島津)；超聲儀(SB25-12DTN，寧波新芝生物科技股份有限公司)；電子天平(CPA225D，德國Sartorius公司)；超純水儀(法國Millipore公司)。

1.2試藥甲醇(色譜純，美國TEDIA天地試劑公司)；水為純化水，其他試劑均為分析純；痔速寧片(批號20140601，20140509，20140614，深圳市國盛源藥業(yè)有限公司)；蘆丁對照品(100080-200607)，沒食子酸對照品(110831-200302)，均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Thermo Acclaim TM 120 C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相組成：甲醇(A)-0.4 mL·L-1磷酸溶液(B)，梯度洗脫：15%A(0 min)，15%A(5 min)，60%A(10 min)，60%A(15 min)，15%A(20 min)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：257與273 nm；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：35 ℃。理論板數(shù)以蘆丁計(jì)不低于5 000，蘆丁和沒食子酸與其他成分分離良好。

2.2溶液的配制

2.2.1對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品10.54 mg與沒食子酸對照品20.43 mg，分別置于50和20 mL量瓶中，加甲醇適量超聲溶解，定容，作為對照品儲(chǔ)備液。精密量取蘆丁儲(chǔ)備液1.5 mL與沒食子酸儲(chǔ)備液2 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備取供試品10片，除去糖衣，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)70%甲醇20 mL，超聲處理30 min，放冷至室溫，加體積分?jǐn)?shù)70%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液再經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3陰性溶液的制備按痔速寧片的處方，不加槐花與五倍子2種藥材，依法制備陰性樣品，按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。

2.3線性關(guān)系考察精密量取蘆丁與沒食子酸對照品儲(chǔ)備液各0.5,1.0,2.0,3.0,4.0和5.0 mL,置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻后按上述色譜條件進(jìn)樣，以峰面積(Y)對質(zhì)量濃度(X，μg·mL-1)進(jìn)行線性回歸，得蘆丁回歸方程：Y=9 966.2X-3 291.4，r=0.999 9(n=6)；沒食子酸回歸方程：Y=15 437X-4 228.7，r=0.999 9(n=6)。結(jié)果表明,蘆丁在進(jìn)樣量10.54～105.4 μg·mL-1、沒食子酸在51.075～510.75 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.4專屬性實(shí)驗(yàn)分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各5 μL，注入HPLC儀，色譜圖見圖1?？梢娞J丁與沒食子酸峰形良好，理論板數(shù)大于5 000，表明處方中的其他成分對蘆丁與沒食子酸的測定無干擾。

2.5精密度實(shí)驗(yàn)取2.2.1項(xiàng)下的對照品溶液5 μL，按2.1項(xiàng)下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄其峰面積，測得蘆丁與沒食子酸峰面積RSD分別為0.8%和0.6%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批號(20140601)樣品5份，按2.2.1項(xiàng)下方法平行制備5份樣品溶液，分別按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，分別測定色譜峰面積，蘆丁與沒食子酸的平均含量為1.12和7.04 mg·片-1，RSD分別為1.0%和1.2%。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一樣品溶液5 μL，每隔3 h進(jìn)樣一次，分別在0，3，6，9，12 h進(jìn)樣，測得蘆丁與沒食子酸峰面積的RSD分別為1.1%和0.9%。

圖1HPLC圖

A.對照品；B.樣品；C陰性樣品；1.沒食子酸；2.蘆丁

Fig.1 HPLC chromatograms

A．chemical reference substance；B.sample；C.blank sample；1.galic acid；2.rutin

2.8加樣回收實(shí)驗(yàn)取已知含量的樣品(批號20140601)約0.1 g，稱取6份，精密稱定，置于25 mL量瓶中，分別加入2種對照品溶液(蘆丁0.210 8 mg·mL-1，沒食子酸1.250 3 mg·mL-1)各1.5,2.0和2.5 mL，照樣品測定項(xiàng)下測定，結(jié)果見表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of the recovery test

(n=6)

注：蘆丁平均回收率=99.23%，RSD=0.67%；沒食子酸平均回收率=99.43%，RSD=0.94%

3討論

3.1檢測波長的選擇利用二極管陣列檢測器對蘆丁與沒食子酸對照品進(jìn)行紫外掃描，分析其紫外吸收圖譜，發(fā)現(xiàn)蘆丁在257和354 nm處有最大吸收，沒食子酸在215和273 nm處有最大吸收。經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，蘆丁在257 nm處、沒食子酸在273 nm處樣品雜質(zhì)峰吸收少，最后選擇257和273 nm作為檢測波長。

3.2流動(dòng)相的選擇參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]，本文曾實(shí)驗(yàn)多種不同比例的甲醇-0.4 mL·L-1磷酸溶液為流動(dòng)相，但是所用時(shí)間較長，為了在相對較短的時(shí)間內(nèi)獲得滿意的分離效果，故采用梯度洗脫，且供試品色譜圖中主峰與相鄰峰能夠完全分離。

3.3提取溶劑的選擇在實(shí)驗(yàn)過程中分別考察了以體積分?jǐn)?shù)100%，70%，50%和30%甲醇作為提取溶劑，結(jié)果體積分?jǐn)?shù)100%甲醇提取效果最差，其余3種溶劑相差不大，考慮到用0.45 μm微孔濾膜濾過時(shí)，體積分?jǐn)?shù)70%甲醇最容易，而體積分?jǐn)?shù)50%和30%甲醇因溶液黏度大不易濾過，故選擇體積分?jǐn)?shù)70%甲醇作為提取溶劑。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此方法簡便、可靠、準(zhǔn)確，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

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Determination of rutin and galic acid in Zhisuning Tablets by HPLC

XU Qichao，CUI Huifang(Ningbo Institute for Drug Control，Ningbo 315048，China)

Abstract:ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of rutin and galic acid in Zhisuning Tablets. MethodsA Thermo Acclaim TM 120 C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)column was used.The mobile phase was acetonitrile-0.4 mL·L-1phosphoric acid solution by gradient elution；the flow rate was 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was set at 257 and 273 nm.The injection volume was 5 μL.The column tempereture was 35 ℃. ResultsThe linear range of rutin was 10.54-105.4 μg·mL-1，(r=0.999 9,n=6)，and galic acid range was 51.075-510.75 μg·mL-1，(r=0.999 9,n=6).The average recovery of rutin was 99.2%， (RSD=0.7%,n=6)，and galic acid was 99.4%，(RSD=0.9%,n=6). Conclusion The method is simple，reliable，accurate, and can be applied to the quality control of the preparation.

Key words:Zhisuning Tablets；rutin；galic acid;HPLC

收稿日期：(2015-04-01)

中圖分類號：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)01-0029-03

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.01.009