朱衛(wèi)敏，李　玲，孫　蓮

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 　830054)

?

一測多評法測定新疆藥桑葉中4種活性成分的含量

朱衛(wèi)敏，李玲，孫蓮*

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830054)

摘要：目的采用一測多評法測定新疆藥桑葉中的4種活性成分的含量。方法采用HPLC測定新疆藥桑葉中4種成分的含量，流動相5 mL·L-1磷酸水溶液(A)-乙睛(B)梯度洗脫(0～8 min，80%～85% A；8～20 min，80% A；20～30 min，80%～95% A); 檢測波長：344 nm。選擇蘆丁為內(nèi)標物，測定其與紫云英苷、異槲皮苷和綠原酸的相對校正因子，計算新疆藥桑葉中4種成分的含量，并比較一測多評法的計算值與外標法實測值的相似度。結(jié)果一測多評法和外標法測得的綠原酸、異槲皮苷和紫云英苷的含量相似度均達到0.999。結(jié)論建立的一測多評法適用于新疆藥桑葉中4種成分的含量測定，相對校正因子可靠。

關(guān)鍵詞：藥桑葉；一測多評法；HPLC；相對校正因子

桑葉為?？浦参锷?Morusalbal)的干燥葉，性寒、味甘、苦，具有疏散風(fēng)熱、清肝明目、清肺潤燥等功能[1]?！侗静菥V目》中記載，桑葉“煎汁代茗，能止消渴”“炙熟煎飲，代茶止渴”，自古就是常用中藥之一[2]。現(xiàn)代研究表明，桑葉具有降血壓、降血糖、降血脂、抗凝等多種藥理作用，其化學(xué)成分主要有黃酮、生物堿、氨基酸等。其中黃酮是其主要有效成分之一，具有降血糖、降血壓、防止動脈硬化、抗衰老、清除人體內(nèi)超氧離子自由基等生理活性[3-4]。新疆藥桑葉主產(chǎn)于新疆南部的和田、喀什、阿克蘇等廣大地區(qū)，具有十分重要的藥用價值。因此分析測定藥桑葉中的多種有效成分對開發(fā)利用新疆藥桑葉資源具有重要意義[5-7]。

采用一測多評法(Quantitative analysis of multicomponents by single-marker，QAMS)，測定新疆藥桑葉中蘆丁、異槲皮苷、綠原酸、紫云英苷含量的文獻還未見報道。一測多評法是采用1個對照品來實現(xiàn)對多種成分的同步測定，對于一些制備困難或價格昂貴的對照品具有實際的應(yīng)用價值[8]。該法也被2010年版《中國藥典》采納。本研究應(yīng)用一測多評法對新疆藥桑葉中多種成分進行質(zhì)量控制，即以蘆丁對照品為內(nèi)標物，通過建立其與綠原酸、異槲皮苷、紫云英苷的相對校正因子(Relative correction factor，RCF)進行含量計算，以降低檢測成本和時間，驗證方法的實用性，為藥桑葉的質(zhì)量控制提供參考和依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1220高效液相色譜儀(Agilent，美國)；Waters 2695高效液相色譜儀(waters，美國)；超聲清洗儀(KQ5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司)；分析天平(Mettler-Teledo，AB135-S，d=0.01/0.1 mg)。

1.2試藥蘆丁(批號100080-200707)、綠原酸(批號110753-200910)、異槲皮苷(批號111809-201102)和紫云英苷(批號114201-200908)均由中國藥品生物制品檢定所提供；乙睛為色譜純(Merck公司)；磷酸為優(yōu)級純(成都市科龍化工試劑廠)；藥桑葉藥材采自于新疆和田、喀什和庫爾勒等地區(qū)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室帕麗達·阿不力孜教授鑒定為藥桑葉。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件依利特-ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：5 mL·L-1的磷酸水溶液(A)-乙睛(B)梯度洗脫(0～8 min，80%～85% A；8～20 min，80% A；20～30 min，80%～95% A)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：室溫；進樣量：20 μL；檢測波長：344 nm；見圖1。

圖1HPLC圖

A.對照品；B.樣品；

1.綠原酸；2.蘆??；3.異槲皮苷；4.紫云英苷

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference standards；B.sample；

1.chlorogenic acid； 2.rutinoside；3.isoquercitrin；4.astragalin

2.2對照品溶液的制備依次精密稱取蘆丁5.02 mg，異槲皮苷5.04 mg，紫云英苷5.04 mg和綠原酸4.88 mg，用甲醇定容至5 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3供試品溶液的制備精密稱取藥桑葉粉末(過三號篩)2.50 g，加入20 mL甲醇(1∶8料液比)。超聲提取(80 W)3次，每次25 min，過濾，濾液濃縮后定容至25 mL量瓶中，搖勻，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾，即得。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1精密度實驗分別配制對照品蘆丁(0.251 mg·mL-1)，綠原酸(0.488 mg·mL-1)，紫云英苷(0.056 mg·mL-1)和異槲皮苷(0.252 mg·mL-1)的混合對照品溶液，按照2.1項下的色譜條件連續(xù)進樣6次。結(jié)果顯示，蘆丁、綠原酸、紫云英苷和異槲皮苷相對峰面積的RSD均<2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2重復(fù)性實驗精密量取同一供試品溶液6份，按照2.1項下色譜條件測定，結(jié)果綠原酸、蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷的RSD在 0.24%～1.8%。

2.4.3穩(wěn)定性實驗取同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，12和24 h進樣，按照2.1項下色譜條件測定，結(jié)果顯示，綠原酸、蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷的RSD在1.2%～2.4%。

2.4.4加樣回收率精密稱取已知含量的同批樣品2.50 g，6份，根據(jù)4種成分的含量精密加入各對照品，按照2.3項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件測定，計算蘆丁、綠原酸、紫云英苷和異槲皮苷的平均回收率分別為95.6%，99.9%，100.5%和96.0%。

2.5線性關(guān)系的考察分別吸取不同體積的蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷和綠原酸的儲備液，用甲醇稀釋至不同體積，制備成含4種成分的5個不同質(zhì)量濃度的系列溶液，按照2.1項下色譜條件測定，以對照品的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標，進行積分處理。各有效成分的回歸方程及線性范圍見表1。

表14種有效成分的線性方程

Tab.1 The linear equations of the four effective compositions

有效成分標準曲線線性范圍/μg·mL-1r蘆丁Y=27.632X-7.8576.3～100.41.0000綠原酸Y=47.598X-58.71712.2～292.80.9991異槲皮苷Y=40.169X-8.60356.3～126.00.9999紫云英苷Y=5.077X-11.28810.1～201.60.9999

2.6相對校正因子選擇蘆丁為內(nèi)標物，按照公式fkm=fk/fm=Wk×Am/(Wm×Ak)，式中Ak為內(nèi)標物的峰面積，Wm為內(nèi)標物的質(zhì)量濃度，Am為其他組分m的峰面積，Wm為其他組分m的濃度。分別計算綠原酸、異槲皮苷和紫云英苷的校正因子，分別記為f綠/蘆，f異/蘆和f紫/蘆，結(jié)果見表2。

表2藥桑葉中3種成分對蘆丁的相對校正因子

Tab.2 The RCF of astragaline，isoquercitrin and chlorogenic acid to rutin

進樣體積/μLf綠/蘆f異/蘆f紫/蘆11.6911.4380.1782.51.6891.4520.17951.7171.4600.18171.7201.4620.18281.7231.4510.183平均值1.7081.4530.181RSD0.9700.6501.150

2.7耐用性和系統(tǒng)適用性考察取2.2項下的各對照品溶液，分別進樣5次，每次進樣5 μL，考察2種高效液相色譜儀和3種色譜柱：依利特-ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Agilent SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Shim-pack-ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，結(jié)果見表3～4。

表3不同色譜儀和色譜柱測得的藥桑葉中3種有效成分的相對校正因子

Tab.3 The RCF of different column chromatography and determination of three kinds of effective components inMorusningra

高效液相色譜儀色譜柱f綠/蘆f異/蘆f紫/蘆Waters-e2695AgilentSB-C18柱1.6921.4650.185Agilent1220依利特-ODS色譜柱1.7081.4530.181Shim-pack-ODS柱1.7061.4540.185AgilentSB-C18柱1.6941.4740.187平均值1.7001.4620.185RSD0.5000.7001.400

表4藥桑葉中各組分的保留時間

Tab.4 The retention time of each component inMorusningra

高效液相色譜儀柱t綠/蘆t異/蘆t紫/蘆AgilentSB-C18柱0.50201.13051.5890依利特-ODS色譜柱0.49461.14201.6060Shim-pack-ODS柱0.50351.12591.5800AgilentSB-C18柱0.50201.13011.5900

表5藥桑葉中各成分的一測多評法與外標法結(jié)果

Tab.5 The results of each component ofMorusningraby external standard method and QAMS

樣品蘆丁綠原酸紫云英苷異槲皮苷外標法一測多評外標法一測多評外標法一測多評10.88112.08402.10680.77310.74810.43210.429120.44500.90010.90460.63800.61470.32000.318430.45711.01621.02460.55410.53310.30010.298341.07322.51232.53910.97720.95030.53020.526150.43100.83410.83760.62430.60010.31800.315560.98812.22102.24340.97510.94960.53910.535670.31210.45310.45160.43400.41220.29420.293981.17801.96321.98181.40711.37860.97110.966490.47101.10801.11780.98920.96530.44700.4457100.60010.66910.66931.49701.47150.61300.6105

經(jīng)過查閱文獻，評價2組數(shù)據(jù)貼近程度的方法主要有夾角余弦法、相關(guān)系數(shù)法、相似度法、模糊分布法和模糊歐氏距離法等[9-10]。分別選用夾角余弦值法、相關(guān)系數(shù)法和相似度3種方法對表5中2組數(shù)據(jù)進行分析，比較2種方法測得結(jié)果的差異性，驗證一測多評法應(yīng)用于多指標成分含量測定的準確性。

夾角余弦法計算公式：

相關(guān)系數(shù)計算公式：

相似度法計算公式：

本文采用相似度法、夾角余弦值法、相關(guān)系數(shù)法、計算外標法與一測多評法測得的綠原酸、紫云英苷和異槲皮苷的含量相似度均為0.999，表明2種方法測得的其他3種成分的含量無顯著性差異。

3討論

蘆丁為新疆藥桑葉的主要有效成分之一，且其對照品容易制備，價格低廉，故被選為內(nèi)標物，利用一測多評法來測量新疆藥桑葉中其余3種有效成分(價格較昂貴)的含量；在確定藥桑葉提取方法時考察了不同的提取溶劑(乙醇、甲醇)，并用正交法對其提取時間、提取功率、料液比和提取次數(shù)進行考察，得出的最優(yōu)條件是以甲醇為提取溶劑，按照1︰8的料液比提取3次、每次提取25 min、提取功率為80 W；在建立蘆丁與其余3種有效成分的相對校正因子時，考察了不同的液相色譜體系、不同色譜柱的影響。結(jié)果表明，一測多評法與外標法測得的含量之間無顯著性差異，說明建立的相對校正因子具有較好的可信度，也說明一測多評法可作為在對照品難以得到的情況下實現(xiàn)對新疆藥桑葉多指標成分進行定量分析與質(zhì)量控制的方法。

參考文獻：

[1]孫海艷，卞超.桑葉黃酮超聲提取最佳工藝條件研究[J].中國科技博覽，2012(13)：281.

[2]賀偉強.桑葉黃酮的提取工藝及藥理功效研究進展[J].北方園藝，2012(21)：181-183.

[3]陳建明，陳建真.桑葉黃酮超聲提取工藝的研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2009，16(1)：42-43.

[4]張帆，劉宏炳，田樹革，等.藥桑中黃酮和多糖的超聲提取與含量測定[J].西北藥學(xué)雜志，2008，23(5):282-283.

[5]嚴安定，袁野，吳亮，等. HPLC法同時測定桑葉中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷的含量[J].安徽醫(yī)藥，2011，15(3):296-298.

[6]孫玲.桑葉的化學(xué)成分研究方法及藥理活性研究進展[J].臨床合理用藥雜志，2012，5(10A):178-179.

[7]楊梅，李新霞，熱娜·卡斯木，等.HPLC雙波長法同時測定藥桑中蘆丁、異虎皮苷、槲皮素和綠原酸的含量[J].西北藥學(xué)雜志，2013，28(2):111-113.

[8]劉香南，李明珠，尚曉娜，等.“一測多評”法測定甘草中6種有效成分含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19(24)：56-59.

[9]楊忠民，李忠民，趙曰利，等.指紋圖譜相似度新算法的研究[J].中國測試技術(shù)，2008，34(3)：141-144。

[10]衛(wèi)俊霞，相里斌，高曉慧，等.基于K-均值聚類與夾角余弦法的多光譜分類算法[J].光譜學(xué)與光譜分析，2011，31(5)：1357-1360.

Determination of four active ingredients inMorusningraby quantitative analysis of multi-components with a single-marker

ZHU Weimin，LI Ling，SUN Lian*(School of Pharmacy, Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a quantitative method with a single-marker(QAMS) for determining the contents of four ingredients in Morus ningra. Methods The contents of 4 ingredients in Morus ningra were determined by HPLC using a mobile phase of 5 mL·L-1phosphoric acid solution (A)-acetonitrile(B) with a gradient elution program (0-8 min，80%-85% A;8-20 min，80% A;20-30 min，80%-95% A)，detection wavelength:344 nm.With rutin as an internal standard，the relative correlation factors (RCF) of astragaline，isoquercitrin and chlorogenic acid to rutin were calculated. The contents of these four ingredients were determined by the external standard method and QAMS，respectively. Results These 2 methods did not show significant difference in assay results with similarity of 0.999.ConclusionQAMS could be used for the quality control of Morus ningra.

Key words:Morus ningra；quantitative analysis of multi-components with a single-marker；HPLC；relative correlation factor

收稿日期：(2015-06-15)

通信作者：*孫蓮，女，教授，碩士生導(dǎo)師

作者簡介：朱衛(wèi)敏，女，在讀碩士研究生

基金項目：新疆醫(yī)科大學(xué)創(chuàng)新 (編號：XJC201316)

中圖分類號：R927.2

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)01-0015-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.01.005