賴菁華，宋小妹

(1.陜西能源職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，西安　710613；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽(yáng)　712046)

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HPLC法測(cè)定窩兒七中5種成分的含量

賴菁華1，宋小妹2*

(1.陜西能源職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，西安710613；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽(yáng)712046)

摘要：目的建立HPLC測(cè)定窩兒七中5種成分含量的方法。方法色譜柱為Cosmosil-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫25 ℃；甲醇-4 mL·L-1磷酸溶液梯度洗脫；流速1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm。結(jié)果4′-去甲基鬼臼毒素(1)、鬼臼毒素(2)、槲皮素(3)、山柰酚(4)和山荷葉素(5)的線性范圍分別為4.5～224.0 (r=0.999 2)，20.0～1 000.0 (r=0.999 4)，1.6～78.0(r=0.999 3)，4.2～210.0(r=0.999 7)和102.2～256.2(r=0.999 4)，平均回收率分別為 99.8%(RSD=1.4%)，99.8%(RSD=1.7%)，99.8%(RSD=1.5%)，99.9%(RSD=2.3%)和98.1%(RSD=1.7%)。結(jié)論該方法靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為窩兒七的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：窩兒七；含量測(cè)定；高效液相色譜法

窩兒七又名窩兒參、阿兒七，為小檗科山荷葉屬植物中華山荷葉(DiphylleiasinensisLi.)的干燥根及根莖，產(chǎn)于陜西眉縣、太白縣、戶縣等，是陜西秦巴特色資源太白七藥之一，具有祛風(fēng)除濕、活血止痛、鎮(zhèn)咳平喘等功效，主治腰腿疼痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、月經(jīng)不調(diào)等[1-4]。現(xiàn)代研究表明，窩兒七主要化學(xué)成分為鬼臼毒素、脫氫鬼臼毒素、山荷葉素、異苦鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、山柰酚、槲皮素等。藥理研究表明，鬼臼毒素具有抗腫瘤作用，黃酮類成分在心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和抗腫瘤方面具有明顯的作用，從而引起人們的廣泛關(guān)注[5-6]。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC法測(cè)定窩兒七中鬼臼毒素、槲皮素、山柰酚的含量[7]，但未見同時(shí)測(cè)定窩兒七藥材中4′-去甲基鬼臼毒素、鬼臼毒素、槲皮素、山柰酚、山荷葉素含量的報(bào)道。本研究在窩兒七化學(xué)成分分離的基礎(chǔ)上，采用HPLC法同時(shí)測(cè)定窩兒七中5種主要化學(xué)成分的含量。該方法靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為制訂窩兒七質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器Waters 2695/2996分析型高效液相色譜儀(Empower工作站，美國(guó)Waters公司)；BP210S電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；基因型18100摩爾超純水機(jī)(重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司)；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲波儀器有限公司)

1.2試藥窩兒七藥材采自陜西秦嶺太白山，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為小檗科山荷葉屬植物中華山荷葉(DiphylleiasinensisLi.)的干燥根及根莖；4′-去甲基鬼臼毒素、鬼臼毒素、槲皮素、山柰酚、山荷葉素對(duì)照品均為實(shí)驗(yàn)室自制，面積歸一化法計(jì)算含量，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均達(dá)到98%以上。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件Cosmosil-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為以甲醇(A)-4 mL·L-1的磷酸水溶液(B)梯度洗脫(流動(dòng)相A 0～5 min，92%～95%；5～25 min，95%～45%；25～70 min，45%～80%；70～100 min，80%)，流速為1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為300 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2對(duì)照品溶液的制備 取4′-去甲基鬼臼毒素、鬼臼毒素、槲皮素、山柰酚和山荷葉素對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為2.24，10.00，0.78，2.10和5.12 mg·mL-1的溶液，作為混合對(duì)照品溶液，備用。

2.3供試品溶液的制備取窩兒七藥材粉末(過4號(hào)篩)約0.50 g，精密稱定，加入20 mL甲醇超聲(220 W，40 kHz，25 ℃)提取2次，每次30 min，濾過，濾液合并，水浴蒸干，殘?jiān)眉状级ㄈ葜?5 mL量瓶中，作為供試品溶液，備用。

2.4線性關(guān)系考察取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用甲醇分別稀釋0，1.2，2.5， 3.5，5.0，10.0和50.0倍，配制成系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣10 μL。以進(jìn)樣量X對(duì)色譜峰面積Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得5種化合物的回歸方程，結(jié)果表明，5種化合物的線性關(guān)系良好。見表1。

表15種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Tab.1 Standard curves of the five constitutes

化合物回歸方程r線性范圍/μg·mL-14'-去甲基鬼臼毒素Y=3×106X-6765.50.99924.5～224.0鬼臼毒素Y=3.6×106X-64290.999420.0～1000.0槲皮素Y=5.9×106X-182880.99931.6～78.0山柰酚Y=1.7×107X-268080.99974.2～210.0山荷葉素Y=6.1×106X-184890.999310.2～512.4

2.5精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取窩兒七供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積，計(jì)算5種化合物的RSD(n=6)分別為1.93%，0.83%，2.82%，1.82%和1.59%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取窩兒七供試品溶液10 μL，分別在0，2，4，8，12和24 h進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果5種化合物峰面積的RSD(n=6)分別為1.82%，0.86%，2.71%，1.51%和1.48%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)稱取窩兒七藥材粉末6份，按照2.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果5種化合物峰面積的RSD(n=6)分別為1.72%，0.89%，2.64%，1.61%和1.61%。結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性良好。

圖1HPLC圖

A.空白溶液；B.混合對(duì)照品溶液；C.供試品溶液；1.4′-去甲基鬼臼毒素；2.鬼臼毒素；3.槲皮素；4.山柰酚；5.山荷葉素

Fig.1 HPLC chromatograms

A.blank solution；B.mixed standard substances；C.test samples；1.4′-demethylpodophyllotoxin；2.podophyllotoxin；3.quercetin；4.kaempferol；5.diphyllin

2.8加樣回收率實(shí)驗(yàn)取已知含量的窩兒七藥材粉末約0.25 g，共6份，精密稱定，每份分別加入一定量的對(duì)照品，置于錐形瓶中并加入20 mL甲醇超聲(220 W，40 kHz，25 ℃)提取2次，每次30 min，濾過，合并濾液，水浴蒸干，殘?jiān)眉状级ㄈ葜?5 mL，得供試品溶液。按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，5種化合物平均回收率分別為99.8%，99.8%，99.8%，99.9%和98.1%，RSD(n=6)分別為1.4%，1.7%，1.5%，2.3%和1.7%。結(jié)果見表2。

表2加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of the recovery test

(n=6)

2.9樣品測(cè)定取3批次窩兒七藥材粉末各3份(過4號(hào)篩，低溫烘干至恒質(zhì)量)，每份約0.50 g，精密稱定，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算3批藥材中4′-去甲基鬼臼毒素、鬼臼毒素、槲皮素、山柰酚、山荷葉素的含量，結(jié)果見表3。

表3窩兒七樣品含量測(cè)定結(jié)果

Tab.3 Results of determination

化合物3個(gè)批號(hào)樣品含量/%201405212014072220140820平均含量/%4'-去甲基鬼臼毒素0.650.650.620.64鬼臼毒素3.813.823.753.79槲皮素0.190.200.180.19山柰酚0.630.650.650.64山荷葉素1.381.361.341.36

3討論

3.1研究意義窩兒七是陜西太白七藥之一，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂尚未開展，嚴(yán)重制約了其使用與開發(fā)。本課題組在窩兒七化學(xué)成分系統(tǒng)分離的基礎(chǔ)上，以其含量較高的主要化學(xué)成分為指標(biāo)，建立快速、準(zhǔn)確的含量測(cè)定方法，為窩兒七質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了依據(jù)。

3.2樣品溶液制備方法的選擇黃酮和木脂素類[9-10]化合物極性較小，因此本次實(shí)驗(yàn)主要考察甲醇、乙醇和水等溶劑回流提取、超聲提取和浸提等不同提取方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇超聲(500 W，50 Hz，25 ℃)2次，每次30 min，能夠?qū)⑺幉闹?種主要成分提取完全，而且方法簡(jiǎn)便，節(jié)省時(shí)間，重復(fù)性好，故確定用甲醇作為提取溶劑。

3.3色譜條件的選擇及優(yōu)化本次實(shí)驗(yàn)主測(cè)成分為極性較小的木脂素和黃酮類化合物，利用反相高效液相色譜法分離效果不是很好，為了探索一個(gè)良好的色譜條件，本實(shí)驗(yàn)考察甲醇-水，乙腈-水，甲醇-磷酸水，乙腈-甲酸水，乙腈-磷酸水，甲醇-甲酸水不同比例洗脫，并結(jié)合全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示，在2.1項(xiàng)下的色譜條件下化合物分離度大于1.5，且峰形對(duì)稱，無拖尾等現(xiàn)象。

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Determination of 5 main constituents in Diphylleia sinensis Li. by HPLC

LAI Jinghua1，SONG Xiaomei2*(1. The Department of Medical Technology of Shaanxi Energy Institute，Xi′an 710613，China; 2. Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a quantitative standard of Diphylleia sinensis Li. . Methods The chromatographic separation was performed on a Cosmosil-C18column (250 mm×4.6 mm，5 μm)；the column temperature was 25 ℃.A linear elution of 4 mL·L-1phosphoric acid aqueous solution-methanol was adopted at a flow rate of 1 mL·min-1.The UV detection wavelength was 300 nm.Results4′-Demethylpodophyllotoxin(1)，podophyllotoxin (2)，quercetin(3)，kaempferol (4)，diphyllin (5) showed good linearity in the range of 4.5-224.0(r=0.999 2)，20.0-1 000.0(r=0.999 4)，1.6-78.0(r=0.999 3)，4.2-210.0 (r=0.999 7) and 102.2-256.2(r=0.999 4)，and the average recoveries were 99.8% (RSD=1.4%)，99.8% (RSD=1.7%)，99.8% (RSD=1.5%)，99.9% (RSD=2.3%) and 98.1% (RSD=1.70%)，respectively. ConclusionThe method is sensitive，accurate and reproducible. It can be used for the determination of main constituents in Diphylleia sinensis Li. .

Key words:Diphylleia sinensis Li.；determination；HPLC

收稿日期：(2015-04-24)

通信作者：*宋小妹，女，博士，教授

作者簡(jiǎn)介：賴菁華，女，講師

基金項(xiàng)目：陜西省中醫(yī)管理局科研項(xiàng)目(編號(hào)：zy09)

中圖分類號(hào)：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)01-0012-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.01.004