作者單位：510120 廣州，中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院消化內(nèi)科

干細胞標志Lgr5在糖尿病小鼠小腸上皮中的表達

鐘獻陽于濤黎潔瑤楊洪生歐陽慧陳其奎

【摘要】目的探討糖尿病小鼠小腸上皮干細胞標志分子G蛋白偶聯(lián)受體5(Lgr5)的表達及干細胞數(shù)量的改變情況。方法采用鏈脲佐菌素腹腔注射的方法建立糖尿病小鼠模型，用免疫組織化學檢查(免疫組化)檢測糖尿病小鼠(6只)與正常小鼠(6只)小腸上皮組織中Lgr5的表達，并分離糖尿病小鼠與正常小鼠原代小腸上皮細胞，采用流式細胞技術(shù)測定Lgr5陽性細胞在上皮細胞中的比例。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示糖尿病與正常小鼠小腸上皮每個隱窩單位的Lgr5陽性細胞數(shù)量分別為(3.7±0.5)個及(1.5±0.6)個，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。流式細胞技術(shù)測得糖尿病與正常小鼠小腸上皮Lgr5陽性細胞比例分別為(28.75±3.69)%及(6.55±1.78)%，前者上皮組織中Lgr5陽性細胞比例顯著高于后者(P<0.05)。結(jié)論鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠小腸上皮Lgr5陽性干細胞數(shù)量增加，Lgr5在糖尿病小鼠小腸上皮細胞高表達。

【關(guān)鍵詞】G蛋白偶聯(lián)受體5；糖尿病；小腸上皮干細胞；原代細胞分離

DOI:10.3969/g.issn.0253-9802.2015.05.004

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81370475)

通訊作者，于濤，E-mail: yutao2014@126.com

收稿日期：(2015-01-15)

Expression of the stem cell marker Lgr5 in the small intestinal epithelium of diabetic miceZhongXianyang,YuTao,LiJieyao,YangHongsheng,OuyangHui,ChenQikui.DepartmentofGastroenterology,SunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China

Correspondingauthor,YuTao,E-mail:yutao2014@126.com

Abstract【】ObjectiveTo measure the expression of the stem cell marker leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5 (Lgr5) in the small intestinal epithelium and investigate the changes in the quantity of stem cells in the diabetic mice. MethodsDiabetic mouse model was established by intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ). The expression levels of Lgr5 in small intestinal epithelial tissues of the diabetic (n=6) and normal mice (n=6) were assessed by immunohistochemistry. Primary intestinal epithelial cells were isolated from the diabetic and normal mice and the percentage of Lgr5-positive cells among epithelial cells were assessed by flow cytometry. ResultsImmunohistochemical analysis revealed that the quantity of Lgr5-positive cells per crypt in the diabetic and normal mice was (3.7±0.5) and (1.5±0.6) with statistical significance (P<0.05). Flow cytometry demonstrated that the percentage of Lgr5-positive cells in the intestinal epithelial cells of the diabetic mice was (28.75±3.69)%, significantly higher compared with (6.55±1.78)% of the normal mice (P<0.05). ConclusionsThe quantity of Lgr5-positive stem cells in the small intestinal epithelium of the STZ-induced diabetic mice was increased. Lgr5 was highly expressed in the small intestinal epithelium of the diabetic mice.

【Key words】Lgr5; Diabetes mellitus; Small intestinal epithelial stem cell; Isolation of primary cell

糖尿病腸病是糖尿病常見并發(fā)癥之一，患者的腸道神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫的正常結(jié)構(gòu)和功能受影響，同時伴有胃腸調(diào)節(jié)功能受損。本病主要臨床表現(xiàn)為頑固性腹瀉、水樣便，或腹瀉與便秘交替出現(xiàn)，其確切發(fā)病機制尚未完全明確[1]。哺乳動物的小腸黏膜上皮是機體營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場所，腸黏膜上皮終生進行著不間斷的自我更新，這依賴于位于腸道隱窩部位的干細胞不斷增值及分化來實現(xiàn)[2]。本研究組新近報道，糖尿病小鼠的小腸上皮存在增殖過度的現(xiàn)象，提示小腸干細胞的狀態(tài)發(fā)生了改變[3]。富含亮氨酸重復(fù)序列G蛋白偶聯(lián)受體5(Lgr5)是小腸干細胞標志分子，本研究旨在通過在體研究及分離原代腸上皮細胞組分，探討糖尿病小鼠與正常小鼠小腸上皮之間是否存在Lgr5陽性干細胞數(shù)量的差異，為后續(xù)研究干細胞功能提供參考數(shù)據(jù)。

材料與方法

一、主要試劑

鏈脲菌素購自Sigma公司；檸檬酸購自廣州化學試劑廠；兔抗小鼠Lgr5抗體購于Santa Cruz公司；免疫組織化學檢查(免疫組化)SP試劑盒購于邁新公司；中性蛋白酶Ⅰ和膠原酶Ⅺ購于Sigma公司；藻紅蛋白標記的二抗購于中杉金橋公司；組織分散液以DMEM液含5%胎牛血清和2%山梨醇配制。

二、實驗動物

實驗動物為C57BL/6J小鼠，共12只，均為雌性，鼠齡6～8周，購于中山大學北校區(qū)實驗動物中心，在中山大學北校區(qū)實驗中心屏障環(huán)境中飼養(yǎng)。所有有關(guān)動物的實驗過程均在中山大學實驗動物倫理委員會的監(jiān)督指導下完成，符合實驗動物倫理學要求。

三、實驗方法

1.糖尿病小鼠模型的建立

將12只C57BL/6J 小鼠隨機分為2組各6只，其中一組作為糖尿病組進行建模，另一組為正常對照組。用無菌0.1 mol/L檸檬酸緩沖液(pH=4.5)溶解鏈脲菌素粉劑制成1%鏈脲菌素液，予糖尿病組腹腔內(nèi)注射新鮮配制的1%鏈脲菌素溶液，劑量為70 mg/kg，1次/日，連續(xù)5 d。對照組給予相同體積的無菌0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液腹腔內(nèi)注射，1次/日，連續(xù)5 d。小鼠血糖大于16.7 mmol/L 并持續(xù)維持在該水平以上則為糖尿病模型建模成功[4-5]。于腹腔注射后第10周處死2組小鼠，沿腹部正中線行切口，取出靠近空腸10 cm片段進行后續(xù)免疫組化及流式細胞技術(shù)檢測。

2.免疫組化檢測小腸上皮Lgr5的表達

將甲醛固定的小腸組織進行石蠟包埋，制備組織切片。切片組織經(jīng)常規(guī)脫蠟水化，過氧化酶阻斷劑輕搖孵育10 min，非免疫羊血清孵育10 min，Lgr5一抗(1∶250稀釋)4℃孵育過夜，二抗37℃孵育30 min，鏈霉素抗生物素-過氧化物酶(SP)孵育10 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色5 min，磷酸鹽緩沖液終止顯色，蘇木素復(fù)染30 s，常規(guī)脫水、封片后置于顯微鏡下觀察。光鏡下觀察Lgr5陽性細胞的位置及表達情況，以在細胞膜及細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為Lgr5陽性表達。由2位醫(yī)師在不知小鼠的來源及分組的情況下閱片，在400倍的觀察條件下，計算視野中每個完整小腸隱窩單位lgr5陽性細胞的數(shù)目。隨機選擇15個視野計數(shù)分析，綜合后取其平均值。

3.原代小腸上皮細胞分離

在解剖鏡下仔細去除剖腹取出的小腸腸系膜。用清洗液沖洗腸管，再用眼科剪沿小腸縱軸剪開腸管，用無菌D-Hanks液清洗7～8遍。將腸管剪成1 mm3大小的碎塊，加入酶消化液(0.1 mg/ml中性蛋白酶Ⅰ和300 U/ml膠原酶Ⅺ)37℃振蕩消化25 min，隨后1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入無菌D-Hanks液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入10 ml組織分散液，吹打均勻，靜置1 min，收集上清液，置于試管中，重復(fù)該步驟4次。將收集的上清液300 r/min離心3 min，沉淀重懸于10 ml組織分散液中，重復(fù)該步驟3次。最后，沉淀重懸液為所分離的小腸上皮細胞，在倒置顯微鏡下進行觀察[6]。

4.流式細胞技術(shù)檢測糖尿病小鼠原代小腸上皮細胞中Lgr5陽性細胞的比例

將分離的小腸上皮細胞組分繼續(xù)用胰酶在室溫下消化3 min，用磷酸鹽緩沖液洗凈后以20 μm細胞過濾網(wǎng)過濾。隨后用磷酸鹽緩沖液調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml。加兔抗小鼠的Lgr5抗體(1∶100稀釋)在室溫下孵育1 h，陰性對照組同時加入等量的磷酸鹽緩沖液代替一抗，用磷酸鹽緩沖液洗3次后加入藻紅蛋白標記的山羊抗兔二抗(1∶200稀釋)避光孵育45 min。細胞重懸為濃度1×106個/ml后取200 μl于EPICS ALTRA流式細胞儀檢測帶藻紅蛋白熒光的細胞的比例，即Lgr5陽性細胞比例。

四、統(tǒng)計學處理

結(jié)果

一、免疫組化結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示，Lgr5分子主要表達在陽性細胞的胞漿及胞膜，呈黃色或棕黃色顆粒(圖1A)。Lgr5陽性細胞主要位于小腸隱窩底部，靠近潘氏細胞。糖尿病組小腸上皮平均每個隱窩單位的Lgr5陽性細胞數(shù)量為(3.7±0.5)個，正常對照組為(1.5±0.6)個，2組間比較差異有統(tǒng)計學意義(圖1B，t=2.532、P=0.028)。

圖1　Lgr5在糖尿病組和正常對照組小鼠小腸上皮組織的表達

A：Lgr5在糖尿病組和正常對照組小鼠小腸上皮組織的免疫組化圖，Lgr5主要表達于細胞質(zhì)與細胞膜，黑色箭頭示Lgr5陽性細胞(SP法,×400)；B：糖尿病組小腸上皮每個隱窩單位的Lgr5陽性細胞數(shù)量顯著高于正常對照組，*為P< 0.05

二、流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果

采用中性蛋白酶Ⅰ和膠原酶Ⅺ聯(lián)合消化法分離到的小腸上皮細胞組分中含有大量單個細胞及隱窩細胞團(圖2A)。流式細胞技術(shù)的檢測結(jié)果顯示，原代分離的糖尿病小鼠小腸上皮細胞中Lgr5陽性細胞比例為(28.75± 3.69)%；正常小鼠小腸上皮細胞中Lgr5陽性細胞比例為(6.55± 1.78)%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(圖2B、C，t=3.079、P=0.017)。糖尿病組小腸上皮細胞中Lgr5陽性細胞比例顯著高于正常對照組。

圖2　糖尿病組與正常對照組小鼠小腸上皮Lgr5陽性細胞比例

A：分離的糖尿病與正常小鼠原代小腸上皮細胞組分，可見大量的上皮細胞及典型的“毛蟲樣”隱窩結(jié)構(gòu)(光鏡下直接觀察，×200)；B：流式細胞技術(shù)檢測糖尿病組與正常對照組小鼠小腸上皮帶藻紅蛋白熒光的Lgr5陽性細胞(上為糖尿病組，下為正常對照組)；C：流式細胞技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)糖尿病組較正常對照組小腸上皮Lgr5陽性細胞比例高，*為P< 0.05

討論

糖尿病腸病是糖尿病患者常見并發(fā)癥之一，發(fā)病率為10%～20%。除具備糖尿病多飲、多食、多尿、消瘦等一般表現(xiàn)外，其特征性表現(xiàn)是腸道功能障礙，頑固性、無痛性腹瀉和吸收不良，稀便或呈水樣便等，其發(fā)病機制可能為內(nèi)臟神經(jīng)疾患、腸道菌群失調(diào)、腸道激素分泌紊亂及膽汁酸吸收障礙等，具體機制尚未完全闡明。此外，Zhao等[7]觀察到糖尿病小鼠的小腸明顯較正常小鼠厚，小腸的濕重及絨毛長度都大于正常小鼠。Peeters等[8-9]發(fā)現(xiàn)糖尿病患者罹患腸道腫瘤的風險大大增加。這些均提示糖尿病患者不僅出現(xiàn)腸道一般功能的改變，其腸上皮增殖過程中也可能存在異常。

小腸上皮干細胞通過不斷自我更新的方式來實現(xiàn)增殖，干細胞在這一過程中逐漸分化為各種腸上皮細胞而組成了隱窩及腸絨毛結(jié)構(gòu)，這也是腸上皮新陳代謝的機制。目前認為，腸隱窩是單克隆的，每一隱窩都起源于各自的干細胞，干細胞通過不對稱分裂有規(guī)律地產(chǎn)生短暫增殖細胞，從而分化為各個類型的成熟小腸上皮細胞。在過去10年中，許多腸上皮干細胞標志分子被相繼提出，Lgr5是新近研究的標志分子。Lgr5是G蛋白偶聯(lián)受體家族的成員之一，Koo等[10]發(fā)現(xiàn)Lgr5在小腸隱窩基底柱狀細胞中高表達，體外培養(yǎng)進一步發(fā)現(xiàn)Lgr5陽性的小腸隱窩基底柱狀細胞能形成所有類型的小腸上皮細胞，證明Lgr5是小腸上皮干細胞的特異性標志分子，這一推測已被業(yè)內(nèi)廣泛驗證和接受。

本實驗組對糖尿病小鼠血糖升高后不同時間點的腸上皮結(jié)構(gòu)進行了研究，發(fā)現(xiàn)第10周小腸上皮濕重增加、絨毛-隱窩高度增加，同時出現(xiàn)增殖過度及上皮的分化異常[3]。因此，本次研究以本實驗組的既往報道為基礎(chǔ)，采用Lgr5作為腸上皮干細胞的標志分子，采用免疫組化檢測糖尿病小鼠與正常小鼠小腸組織中Lgr5蛋白的表達情況，結(jié)果示Lgr5主要定位于小腸隱窩基底部，同時，糖尿病小鼠小腸上皮每個隱窩的Lgr5陽性細胞數(shù)量顯著高于正常小鼠。由于Lgr5為跨膜蛋白，在細胞膜表面存在免疫原性，為進一步驗證免疫組化的結(jié)果，我們采用流式細胞技術(shù)進一步測定糖尿病與正常小鼠小腸上皮細胞中Lgr5陽性細胞的比例。在這一實驗過程中，我們用中性蛋白酶Ⅰ和膠原酶Ⅺ聯(lián)合消化法分離小鼠小腸上皮細胞，該方法不僅能獲得較純的小腸上皮細胞，而且對細胞的損傷作用小，有利于后續(xù)流式細胞儀的分析[11]。本研究的流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果示，糖尿病小鼠小腸上皮Lgr5陽性細胞比例顯著高于正常小鼠。免疫組化及流式細胞技術(shù)的檢測結(jié)果均表明糖尿病小鼠小腸上皮中Lgr5陽性干細胞的數(shù)量明顯增加，提示Lgr5陽性干細胞的狀態(tài)改變與糖尿病小腸上皮改變的發(fā)生或者發(fā)展相關(guān)。

作為干細胞的分子標志物，Lgr5陽性細胞在糖尿病小鼠小腸上皮中的比例和數(shù)量增加，提示小腸上皮處于增殖活躍狀態(tài)，這與糖尿病狀態(tài)下的小腸較正常對照狀態(tài)濕重增加相吻合。Nakata等[12]的研究示Lgr5在包括結(jié)腸癌的多種腫瘤組織中高表達，顯示出Lgr5陽性干細胞的改變可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也有關(guān)系。Lgr5陽性干細胞在糖尿病小鼠小腸上皮中數(shù)量增加在一定程度上也提示了糖尿病可能與腸道腫瘤相關(guān)的原因。增多的Lgr5陽性細胞可能作為腫瘤干細胞的來源，或者引起腸黏膜的快速更新或分化不良，導致糖尿病患者腸道腫瘤的高發(fā)。這一假設(shè)還需要在今后的工作中作進一步研究加以驗證。

綜上所述，糖尿病小鼠小腸上皮中Lgr5陽性干細胞數(shù)量增加，提示Lgr5陽性干細胞的狀態(tài)改變與糖尿病小腸上皮改變存在一定的相關(guān)性。

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(本文編輯：洪悅民)

臨床研究論著