魏潔書++王煥++戴慧明++卿志浩++楊錦芬

摘要：HMGR和DXR分別是萜類生物合成途徑——MVA和MEP途徑的2個關鍵酶。本研究對煙草施用HMGR和DXR的專一抑制劑洛伐他?。∕EV）和膦胺霉素（FSM），測定煙草NtHMGR、NtDXR、FPPS和GGPPS基因轉錄水平、HMGR和DXR酶活性變化。結果表明，抑制劑處理后煙草內源基因NtHMGR和NtDXR表達量在24h受到明顯抑制；HMGR和DXR活性均在一定時間內受到抑制。MEV和FSM能有效抑制煙草中HMGR和DXR的活性。

關鍵詞：3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）；1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶（DXR）；洛伐他??；膦胺霉素

中圖分類號：TS411文獻標識碼：A

植物萜類化合物的生物合成至少有2條途徑。細胞質中的甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway，MVA途徑）；質體中的2-甲基赤蘚糖醇-4-磷酸途徑（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway，MEP途徑）[1]。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGR）和1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）分別是MVA和MEP上游途徑中的2個關鍵酶[2，3]。

洛伐他?。╩evinolin，MEV）是HMGR的專一抑制劑，它能與HMGR的活性部位結合，競爭性抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）轉變成甲羥戊酸（MVA）[4，5]；膦胺霉素（fosmidomycin，F(xiàn)SM）是DXR的專一抑制劑，它能阻斷1-去氧木糖-5磷酸（DXP）合成2-甲基赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）[6，7]。

1材料與方法

1.1材料

野生型煙草“中煙90”種子，由廣州中醫(yī)藥大學中藥資源科學與工程研究中心保存。

1.2主要儀器與試劑

MEV（美國Sigma公司）；FSM（美國Sigma公司）； CFX96熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；UV-1800型紫外分光光度計（日本島津公司）。

1.3方法

1.3.1考察抑制劑噴施濃度和取樣時間

考察噴施濃度和取樣時間：播種煙草種子，溫室培養(yǎng)至三葉一心期（苗齡約6周），進行噴施。植株分為4組，分別噴施MEV、MEV溶劑對照、FSM、純水對照，連噴3d，觀察植株生長情況，取致植株全部白化或變形的最低濃度為抑制劑最適濃度。未處理煙草長至6個月，噴施最適濃度抑制劑，噴施前采樣作為0h樣品，噴施處理6h、12h、24h、36h、48h后各采集葉片100mg，提取RNA，熒光定量PCR檢測。引物見表1，引物退火溫度篩選、標準曲線建立方法參考文獻[8]。反應條件為：95℃ 30s；95℃ 3s，60℃ 5s，40個循環(huán)。采用比較Ct值法[9]計算基因相對表達量F，公式為F=2-△△Ct，其中△△Ct=（待測組目的基因Ct值-待測組內參基因Ct值）-（對照組目的基因Ct值-對照組內參基因Ct值）。0h樣品檢測NtHMGR、NtDXR基因表達量，MEV及對照噴施組檢測NtHMGR基因的表達量，F(xiàn)SM及對照噴施組檢測NtDXR基因表達量。

1.3.2基因表達量和酶活性的測定

用考察濃度后的抑制劑噴施苗齡6個月的煙草，測定煙草內源基因NtHMGR和NtDXR、下游基因FPPS和GGPPS表達量。噴施前采樣作為0h樣品，噴施處理24h、36h、48h后各采集煙草葉片100mg。酶活性的測定根據(jù)底物專一性原理，具體測定方法參考文獻[10]。煙草葉片于MEV噴施處理后12h、24h、48h后采集，F(xiàn)SM噴施處理后24h、48h后采集。

2實驗結果

2.1確定MEV和FSM噴施煙草最適濃度和取樣時間

MEV噴施煙草后，葉片呈現(xiàn)皺縮的現(xiàn)象，如圖1，使用不同濃度MEV噴施后，煙草皺縮苗率有所不同，用350μmol/L噴施后，煙草皺縮苗率達到57.5%，而400μmol/L噴施后皺縮苗率僅為45%，溶劑噴施后葉片沒有出現(xiàn)皺縮（圖2）。故采用350μmol/L的MEV為最適噴施濃度。

a.噴施MEV后的皺縮苗b.噴施溶劑后的正常苗圖1350μmol/L MEV和溶劑噴施后煙草幼苗表型對比

圖2不同濃度MEV噴施煙草幼苗后的皺縮苗率

FSM噴施煙草后，葉片呈現(xiàn)黃化及白化的現(xiàn)象，如圖3，使用不同濃度FSM噴施后，煙草黃白苗所占比例有所不同，用75μmol/L噴施后，黃苗率達到67.5%，用100μmol/L噴施后，白苗率達到82.5%，用150μmol/L和200μmol/L噴施后，白苗率都達到95%，其余5%均出現(xiàn)黃化（圖4），說明150μmol/L FSM處理煙草即可達到效果，故采用150μmol/L為最適噴施濃度。

a.噴施FSM后的白化苗b.噴施純水后的正常苗圖3150μmol/L FSM和純水噴施后煙草幼苗表型變化

圖4不同濃度FSM噴施煙草幼苗后的黃白苗率

專一抑制劑噴施煙草后，對應的基因表達量會隨著時間的變化有所降低和升高。NtHMGR表達量在36h達到最高值，為未處理的4.34倍，如圖5-a。NtDXR基因表達量在36h達到最高值，為未處理的6.26倍，如圖5-b。

根據(jù)圖5變化趨勢確定基因表達量采樣時間為24h、36h、48h，HMGR酶活性為12h、24h、48h，DXR酶活性為24h、48h。a.MEV噴施煙草NtHMGR基因表達量變化b.FSM噴施煙草NtDXR基因表達量變化圖5專一抑制劑噴施煙草后NtHMGR和NtDXR表達量變化

2.2噴施MEV和FSM對煙草基因表達量和酶活性的影響

2.2.1基因表達量變化

MEV噴施煙草后，NtHMGR表達量在36h達到最高值，如圖6-a。FSM噴施后，NtDXR基因表達量在36h有一個低谷，36～48h出現(xiàn)升高，如圖6-b。MEV噴施后，F(xiàn)PPS與GGPPS表達量在36h達到最高值，在48h回到原水平，與NtHMGR表達變化呈現(xiàn)一致的趨勢，如圖6-c。FSM噴施后，F(xiàn)PPS表達量緩慢升高，GGPPS表達量變化不大，如圖6-d。圖6MEV及FSM噴施野生型煙草后基因表達量變化

2.2.2HMGR和DXR活性變化

煙草在噴施專一抑制劑MEV后，HMGR活性在12h、24h和48h分別是溶劑對照的0.82倍、0.80倍和1.29倍。12h和24h時HMGR活性受到抑制，48h HMGR活性出現(xiàn)了反饋性的提高，如圖7-a。噴施FSM后，煙草內的DXR活性在24h和48h分別是溶劑對照的1.3倍和0.485倍，DXR活性在48h受到抑制，如圖7-b。

3討論

作為植物中萜類生物合成途徑MVA途徑和MEP途徑中關鍵酶的抑制劑，洛伐他?。∕EV）和膦胺霉素（FSM）已經(jīng)被廣泛應用于HMGR和DXR的調控研究[11，12]。本文對煙草施用MEV和FSM，抑制了HMGR或DXR酶活性，煙草內源基因NtHMGR、NtDXR，下游基因FPPS、GGPPS表達量在一定時間內有所提高。a.煙草噴施MEV和溶劑對照HMGR活性比較b.煙草噴施FSM和溶劑對照DXR活性比較圖7煙草噴施抑制劑和溶劑對照酶活性含量比較

噴施抑制劑MEV后，煙草HMGR活性在12～24h受到抑制后，NtHMGR基因及下游FPPS、GGPPS基因表達水平均出現(xiàn)反饋性提高，從而彌補了HMGR由于受抑制而降低的現(xiàn)象，增加HMGR的合成，在48h時測定的HMGR活性回升至比對照更高的水平，推測此時NtHMGR基因轉錄由于已滿足HMGR的合成需求，因此又回落至處理前水平，下游基因表達水平也在此時回落。Joseph和Ross[13]研究發(fā)現(xiàn)，在煙草細胞培養(yǎng)液中添加一定濃度的MEV，可使細胞內HMGR活性比對照減少33%以上，本實驗煙草噴施MEV后HMGR活性在24h內受到抑制。噴施抑制劑FSM后，煙草DXR活性在24h并未受到明顯影響，NtDXR基因及下游FPPS、GGPPS基因表達水平也與對照持平，在48h時DXR活性受到抑制，NtDXR基因表達出現(xiàn)一個明顯上升的趨勢，說明此時基因轉錄水平出現(xiàn)了反饋性的提高，下游FPPS基因表達水平也隨之逐漸上升。用HMGR和DXR的專一抑制劑處理煙草后，相應的酶基因及部分下游基因表達水平有明顯增加，表明煙草體內對抑制劑處理具有明顯的反饋補償作用，由于抑制劑抑制了IPP合成途徑中關鍵酶的活性，導致IPP來源不足，細胞通過增加關鍵酶基因轉錄水平的表達來抵消抑制劑的作用。

4結語

本文結果表明，通過對煙草施用MVA途徑和MEP途徑中關鍵酶HMGR和DXR的專一抑制劑洛伐他?。∕EV）和膦胺霉素（FSM），在一定時間內抑制了HMGR或DXR酶活性，煙草內源基因NtHMGR、NtDXR，下游基因FPPS、GGPPS表達量在一定時間內有所提高，該結果為利用MEV和FSM抑制植物萜類的合成，以及進一步闡明萜類化合物2條生物合成途徑間的協(xié)同作用奠定了良好的實驗基礎。

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