吳文梅 李彩婷 楊婉瑩*

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣州 510642）

真菌是生物界中很大的一個類群，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)對人類有致病性的真菌約有300多個種類[1]。市面上所用抗真菌類藥物，副作用大，易產(chǎn)生抗藥性[2]。而抗真菌肽卻有望解決這些弊端。

抗真菌肽Drosomycin來自于果蠅，屬于天然蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量小，熱穩(wěn)定性好，遇水易溶解，可作為抗生素的替代品，為我們解決抗生素耐藥性提供新材料[3][4]。楊婉瑩等從2002年開始對抗真菌肽及其家族蛋白的研究，結(jié)果表明Drosomycin對絲狀病原真菌具有廣譜的抑制活性，可以作為新的抗真菌藥物的靶標[5][6][7]。但Drosomycin在果蠅體內(nèi)含量極微，天然資源有限，提取步驟煩瑣、成本高，得率低，不利于工業(yè)生產(chǎn)[8]。因此利用分子生物學(xué)技術(shù)進行體外表達成為研究熱點。

Drosomycin成熟肽包括44個氨基酸，其中8個半胱氨酸形成4對二硫鍵，由于結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，在利用原核系統(tǒng)表達該蛋白時往往形成包涵體，后續(xù)純化復(fù)性步驟復(fù)雜，不利于實際利用。本實驗利用大腸桿菌原核生物表達系統(tǒng)，通過對冷休克表達載體pcold TF進行改造，實現(xiàn)Drosomycin體外的可溶性表達，為下一步生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，同時為探索富含二硫鍵的蛋白在體外的分離純化提供一條線索。

1 材料與方法

1.1 材料，質(zhì)粒

果蠅細胞sf9由本實驗室保存,大腸桿菌E.coli（DH5α）感受態(tài)細胞，BL21（DE3）感受態(tài)細胞均購自北京天根生物公司；質(zhì)粒pCold TF由崔玉寶教授贈送。

1.2 酶類及其他試劑

胰蛋白胨（Tryptone）、酵母抽提物（Yeast Extract）、氯化鈉（NaCl）為上海生物生工有限公司產(chǎn)品；氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）、異丙基硫代β-D半乳糖苷（IPTG）、X-gal、預(yù)染蛋白Marker購自廣州翔博生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì) Maker、RNA酶A，Western blot膜封閉液購自北京天根生物公司；Trizol Reagents總RNA抽提試劑盒，各規(guī)格DNA Marker、限制性內(nèi)切酶(NdeⅠ、XhoⅠ)、PCR聚合酶、反轉(zhuǎn)錄用試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser）、T4 DNA ligase、pMD19-T 載體、Primer-STAR DNA 聚合酶、dNTP Mixture（各 10 mmol/L）均購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；鼠抗Penta-His抗體購置碧云天生物技術(shù)有限公司；HRP-兔抗鼠結(jié)合物購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Ni-NTA親和層析填料鎳購自伯樂生物科技有限公司。其他化學(xué)試劑均是國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 果蠅細胞sf9的DNA提取

取實驗室培養(yǎng)的果蠅細胞sf9,待平板長到80%-90%時，加入Trizol裂解細胞，隨后將平板中的細胞轉(zhuǎn)入1.5 ml的EP管中，按照常規(guī)方法氯仿/異丙醇步驟變性蛋白質(zhì)，抽提其RNA[9],最后利用試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成DNA，于-20℃保存。

1.3.2 抗真菌肽Drosomycin基因的PCR擴增

根據(jù) NCBI上已登錄 (NM079177)的Drosomycin(Drs)基因序列設(shè)計了一對引物，上游引物 Drs-F:5’-CGCCATATGGACTGCCTGTCCGG-3’（橫線所示為NdeⅠ酶切位點），下游引物 Drs-R:5’-CCGCTCGAGTTAGCATCCTTCGCA-3’（橫線所示為 XhoⅠ酶切位點），引物由上海生物生工有限公司合成。

以抽提果蠅的DNA為模板，用上述引物擴增Drs編碼基因，PCR反應(yīng)體系包括TaKaRa Taq （5 U/μl） 0.25 μl；10×PCR Buffer（Mg2＋Plus）5 μl；dNTP Mixture（各2.5 mM） 4 μl；上游引物（20 μM）1 μl；下游引物（20 μM） 1 μl；cDNA First-strand 1μl，添加滅菌ddH2O至總體積為50 μl。PCR反應(yīng)：預(yù)變性98℃ 5 min，變性98℃30 s，退火 55 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，32個循環(huán)，延伸72℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，用天根膠回收試劑盒切膠回收目的基因。

1.3.3 重組載體pCold TF-Drs的構(gòu)建

質(zhì)粒pCold TF和體外擴增的目的基因Drs用限制性內(nèi)切酶Nde I和XhoI進行雙酶切，50 μl酶切體系為：質(zhì)粒DNA/Drs 30 μl，10xH bueffr 5 μl，XhoI 2.5 μl，NdeI 2.5 μl，加 ddH2O 10 μl補足 50 μl酶切體系，37℃酶切8 h。1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物，在紫外燈下用無菌手術(shù)刀片切下線狀載體DNA和PCR產(chǎn)物的條帶，按膠回收試劑盒說明書操作，回收目的載體片段和PCR產(chǎn)物。將Drs的酶切純化產(chǎn)物和表達載體pCold TF的酶切純化產(chǎn)物于16℃連接8 h，反應(yīng)體系10 μl：PCR純化產(chǎn)物5 μl，pCold TF 酶切產(chǎn)物 3 μl，T4 ligase 1 μl，T4 ligase buffer 1 μl. 然后轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細胞。將通過菌液PCR鑒定成功的重組質(zhì)粒送上海生工測序。

1.3.4 重組載體pCold TF-Drs的誘導(dǎo)表達及SDS-PAGE鑒定

將測序正確的pCold TF-Drs轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中,利用含有Amp(氨芐青霉素)抗性的平板篩選陽性重組子。將篩選成功的含有pCold TF-Drs重組菌BL21(DE3)單菌落,接種到LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)箱過夜振蕩培養(yǎng)，然后取菌液按1:100體積比轉(zhuǎn)接LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)3 h至 OD600nm=0.4-0.5左右，添加IPTG 0.5 mM進行誘導(dǎo)表達，15℃培養(yǎng)24 h。收集細菌，用適量PBS重懸后進行超聲破碎，超聲6 s,間隔10 s,超聲90次，菌體破碎液用低溫離心機進行收集，10 000 r/min，4℃，離心30 min，分別取全蛋白、超聲破碎上清、超聲破碎沉淀各16 μl,加入4 μl 5X SDS loading buffer,100℃加熱10 min變性蛋白，用12%聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE電泳，結(jié)束后用考馬斯亮藍G250染色。

1.3.5 Western blot鑒定

按上述方法進行SDS-PAGE,然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜,電泳儀參數(shù)設(shè)置為電壓100 V，70 min,將PVDF膜置于含5%脫脂奶粉中，至搖床上室溫封閉30 min；倒出封閉液，加入4 ml脫脂奶粉稀釋的一抗（抗His標簽鼠單抗），稀釋比例為1:1 000，盡可能排除氣泡，于搖床4℃雜交過夜。使用后回收一抗；去除一抗后將膜用20 ml TBST清洗3次，每次置于搖床清洗10 min；將膜置于新的平皿中，加入4 ml脫脂奶粉稀釋的二抗（HRP標記山羊抗小鼠IgG），稀釋比例為1:1 000，至搖床上室溫孵育2 h以上；去除一抗后將膜用20 ml TBST清洗3次，每次置于搖床清洗10 min；將洗好的PVDF膜置暗房中，滴加發(fā)光液進行化學(xué)發(fā)光顯色，X光膠片曝光顯影定影后保存膠片。

1.3.6 融合蛋白的分離純化

重組融合蛋白的純化是通過Ni-NTA親和層析柱完成，具體過程主要包括以下步驟：先取一定量的Ni-NTA填料，加到柱子里，用10個柱體積的PBS對柱子進行洗滌與平衡；蓋緊下面的帽子，取超聲破碎的上清加入到柱子中，蓋緊上面的帽子，4℃，旋轉(zhuǎn)混勻30 min；固定柱子，摘掉兩個帽子，讓溶液全部自然流下，收集樣品，用于檢驗；用含有25 mM咪唑的PBS清洗柱子，直到OD280沒有變化時，停止洗滌；分別用含有25 mM，50 mM，100 mM，150 mM，300 mM 咪唑 Tris洗脫柱子上的目的蛋白，收集蛋白，通過SDS-PAGE進行染色檢測是否干凈；用含有1 M咪唑的Tris，清洗柱子，使柱子上的蛋白完全洗下來；用0.5 M NaOH清洗柱子；用20%酒精保存柱子。分別檢驗不同濃度的咪唑洗脫液中的蛋白，取收集的各管蛋白制樣，進行SDS-PAGE檢測，檢測洗脫目的蛋白的最適咪唑濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組載體pCold TF-Drs的構(gòu)建

以果蠅的DNA為模板，PCR擴增目的基因Drosomycin，電泳檢測目的條帶符合預(yù)期大?。▓D1）。切膠回收目的條帶，酶切后連接到pCold TF載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞（圖2），將構(gòu)建成功的重組載體pCold TF-Drs送上海生物生工公司測序，結(jié)果與預(yù)期的一致。

2.2 質(zhì)粒pCold TF-Drs原核表達及鑒定

取測序成功的重組質(zhì)粒pCold TF-Drs轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，挑取單菌落培養(yǎng)至OD600為0.4用IPTG進行誘導(dǎo)，15℃培養(yǎng)24 h，離心收集菌體超聲破碎，收集樣品進行SDS-PAGE電泳，并進行Western-blotting檢測，結(jié)果如圖3、圖4所示。從圖中可以看出融合蛋白TF-Drs表達的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小為60 ku(所含Drs為5 ku)，與預(yù)期結(jié)果一致。Western blot結(jié)果也顯示攜帶His標簽的融合蛋白可以與鼠抗Penta-His抗體識別。

2.3 融合蛋白pCold TF-Drs的分離純化

將15℃表達的細菌裂解液上清，通過Ni-NTA柱親和層析純化，洗脫咪唑濃度梯度依次為20 mM、40 mM、60 mM、300 mM。分別取每個濃度梯度的洗脫液，進行12%SDS-PAGE檢測，檢測結(jié)果如圖5所示，可見：細菌裂解液上清中呈可溶性表達，融合蛋白pCold TF-Drs在Ni-NTA柱洗脫咪唑濃度為300 mM時，洗脫純化效果最好。經(jīng)Ni-NTA柱親和層析純化，獲得300 mM咪唑的洗脫液，進一步使用分子篩SephadexP-10層析柱去除咪唑和脫鹽。脫鹽后的融合蛋白再使用10 KDa的超濾管進行超濾濃縮，獲得的融合蛋白pCold TF-Drs經(jīng)SDS-PAGE檢測，表明融合蛋白得到很好的純化(圖6)。

圖1 目的基因Drs擴增電泳圖

圖2 pCold TF與Drs雙酶切回收電泳圖

圖3 融合蛋白TF-Drs的SDS-PAGE檢測

圖4 融合蛋白TF-Drswestern blot檢測

圖5 融合蛋白TF-Drs的Ni-NTA純化

圖6 融合蛋白TF-Drs的脫鹽純化

3 討論與結(jié)論

大腸桿菌原核生物表達系統(tǒng)由于其生長周期短，生長速度快，轉(zhuǎn)化外源DNA操作簡單，可以大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，被認為是一種體外合成重組蛋白最簡單的外源表達系統(tǒng)，但是多數(shù)情況下外源表達產(chǎn)物形成非活性的包涵體蛋白，不利于后續(xù)實驗[10]。本實驗室前期構(gòu)建過pET 3C-Drs表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化進大腸桿菌BL21（DE3）后，目的蛋白主要以包涵體的形式表達，需要變性，復(fù)性，不利于生產(chǎn)操作[11]。pCold TF-Drs作為表達載體與pET系列載體對比而言，它具有TF標簽可以促進目的蛋白的可溶性表達，純化簡單，標簽容易移除。同時，它還是是一個低溫冷休克表達載體，表達目的蛋白穩(wěn)定[12]。

通過本次實驗，確定了將目的基因抗真菌肽Drosomycin定向克隆到原核生物表達載體pCold TF后，將構(gòu)建正確的重組載體pCold TF-Drs轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)外源蛋白表達，SDS-PAGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)獲得的目的蛋白相對分子質(zhì)量單位為60 kDa，與預(yù)期值（55 kDa+5 kDa=60 kDa）相一致。Western Blot結(jié)果也表明，該蛋白可被鼠抗His抗體識別，表明在大腸桿菌BL21（DE3）中的表達的蛋白是目的蛋白。通過超聲破碎 pCold TF-Drs轉(zhuǎn)化菌（BL21），用SDS-PAGE顯示其大部分在上清中，表明是可溶性表達。

本實驗成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCold TF-Drs,實現(xiàn)了目的蛋白在原核生物表達系統(tǒng)中的可溶性表達，為下一步酶切純化出抗真菌肽Drosomycin實現(xiàn)生產(chǎn)上的利用，對植物類病原真菌的抑菌活性檢測，藥理藥效的研究以及開發(fā)抗真菌藥物奠定了基礎(chǔ)。

[1]Liao W Q,Wu S X.Fungi Disease Research Progress[J].Shanghai Publis hing House of Second Military Medical U-niversity,1998.

[2]郝飛,葉慶佾.抗真菌藥物作用靶位的研究進展[J].中國皮膚性病學(xué)雜志,2001,15(2):123-124.

[3]張學(xué)敏,金莉莉,王錚,等.抗菌肽在大腸桿菌中的融合表達[J].生物工程學(xué)報,2014(08):117.

[4]Meister M,Lemaitre B,Hoffmann J A,et al.Drosophila responds to a septic injury by the rapid synthesis of antimicrobial[J].Bioessays,1997,19(11):10-19.

[5]Yang W Y,Wen S Y,Huang Y D,et al.Functional divergence of six isoforms of antifungal peptide Drosomycin in Drosophila melanogaster[J].Gene,2006,379:26-32.

[6]鐘仰進,肖業(yè)臣,魏劍波,等.果蠅 Drosomycin 基因(drs)的克隆鑒定[J].蠶業(yè)科學(xué),2004,30(1):85-89.

[7]肖業(yè)臣,溫碩洋,黃亞東,等.昆蟲抗菌肽和抗真菌肽結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及分子設(shè)計[J].昆蟲學(xué)報,2004(05):659-669.

[8]Lemaitre B,Reichhart J,JμLes A,et al.Drosophila host defense:Differentialinduction ofantimicrobialpeptide genes after infection by various classes of microorganisms[J].Proc.Natl.Acad.Sci.1997,94:14614-14619.

[9]Sambrook.J.MolecμLar Cloning[M].科學(xué)出版社,2008:1949.

[10]Rosano G L,Ceccarelli E A.Recombinant protein expression in Escherichia coli:advances and challenges[J].Frontiers in microbiology,2014,5:172-189.

[11]桑延霞,鄧小娟,楊婉瑩,等.昆蟲抗真菌肽基因的分泌型表達及活性鑒定[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,40(4):842-849.

[12]Saini P,Wani S I,Kumar R,et al.Trigger factor assisted folding of the recombinant epoxide hydrolases identified from C.pelagibacter and S.nassauensis[J].Protein Expression and Purification,2014,104:71-84.