體外誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)豬的ips細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化

張鼎，張曉姍，王祎

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，北京100094)

摘要：項(xiàng)目的主要目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)豬的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)向神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)體外誘導(dǎo)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)探索的過程中，我們使用了傳統(tǒng)的誘導(dǎo)分化形成神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的方法，即通過擬胚體(EB)的形成并添加維甲酸(RA)進(jìn)行誘導(dǎo)。豬的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)經(jīng)歷了傳代培養(yǎng)、擬胚體(EB)時(shí)期、誘導(dǎo)分化時(shí)期三個(gè)重要階段，生成一類新的細(xì)胞。最后我們使用免疫熒光法檢測(cè)到新的細(xì)胞中存在神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物 Nestin、神經(jīng)元標(biāo)志物β- tubulin III以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP表達(dá)，從而確定這類新的細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞?？梢?豬的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)經(jīng)過這種傳統(tǒng)誘導(dǎo)分化方法培養(yǎng)可分化為具備基礎(chǔ)特征的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)，能夠表達(dá)出神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)特異的標(biāo)志分子nestin。

關(guān)鍵詞：豬；誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞；神經(jīng)干細(xì)胞；體外誘導(dǎo)

文章編號(hào)：1672-6758(2015)06-0059-5

中圖分類號(hào)：Q28

2006年, Takahashi等將四種轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4導(dǎo)入已分化的小鼠皮膚成纖維細(xì)胞,獲得了類似于胚胎干細(xì)胞(ESCs)的多能性干細(xì)胞, 命名為“誘導(dǎo)多能干細(xì)胞”(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。[1]小鼠和人[2]的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系(iPSCs)最先被建立起來，不同種類的畜牧類動(dòng)物的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系(iPSCs)也相繼被建立起來，如豬[3]、綿羊[4]。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)作為一種新型的多能干細(xì)胞，儼然已經(jīng)成為干細(xì)胞界的寵兒，其開發(fā)的潛力也是無窮的。隨著研究的不斷深入，人們?cè)趯?duì)比誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)和胚胎干細(xì)胞(ESCs)的過程中，發(fā)現(xiàn)了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)擁有很大的優(yōu)勢(shì)。一方面，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)由受體自身的細(xì)胞重新編碼生成，不會(huì)誘發(fā)免疫反應(yīng)。例如，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療領(lǐng)域，結(jié)合不同的病情，使用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)誘導(dǎo)分化成不同類型的神經(jīng)細(xì)胞，能夠有效地避免免疫排斥，為臨床治療打下了基礎(chǔ)。[5]另外一方面，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)能夠有效地避免倫理學(xué)帶來的問題。雖然誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)依然存在著很多不穩(wěn)定的因素以及爭(zhēng)論，但是不可否認(rèn)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)為再生醫(yī)學(xué)提供了一個(gè)全新的方向。[6]

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)的研究在小鼠和人的身上都得到了很大的進(jìn)步，但是目前體內(nèi)試驗(yàn)依舊局限于小鼠的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)上。如果小鼠模型得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接應(yīng)用到人的身上，是要承擔(dān)很大的風(fēng)險(xiǎn)的。小鼠和人在生理結(jié)構(gòu)和免疫特性上區(qū)別很大，主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：1.干細(xì)胞系多能性維持的主要信號(hào)通路不同。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)多能性維持因子是白血病抑制因子(leukemia inhibitor factor，LIF)、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transducers and activators of transcription, STAT),即LIF/STAT3信號(hào)通路。[7]人的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)多能性維持依賴于堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和激活素(Activin)/節(jié)點(diǎn)信號(hào)[6]。2.小鼠生命周期過短，是一種很難實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間追蹤的醫(yī)學(xué)模型。所以我們需要另外一種模式生物，實(shí)現(xiàn)小鼠和人之間的過渡。豬作為傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)模型，在生理學(xué)和解剖學(xué)與人類具有很高的相似性。[8]同時(shí)經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，豬和人的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系(iPSCs)在維持多能性方面的信號(hào)通路具有相似性。[9]而且豬和小鼠的生命周期相比較長(zhǎng)，容易進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的追蹤。

因?yàn)樨i的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)相對(duì)小鼠和人的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)是一種新興的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)，細(xì)胞系的建立自身也不是十分完善，很多地方存在缺陷。由于缺少相關(guān)文獻(xiàn)的支持，我們只能依照著胚胎干細(xì)胞(ESCs)定向誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)干細(xì)胞的傳統(tǒng)方法，即通過擬胚體的形成并添加維甲酸(RA)進(jìn)行誘導(dǎo)。

1試劑與材料

(1)ES培養(yǎng)基的配制: KnockoutTM DMEM 培養(yǎng)基(Gibco)， ES FBS(15%)，Glutamin(100x)，NEAA(100x)，β-mer(1000x)，Lif(1000x)；

(2)ES培養(yǎng)基的配制: DMEM/F12(1︰1) 培養(yǎng)基(Gibco), ES FBS(15%)，Glutamin(100x)，NEAA(100x)，β-mer(1000x)；

(3)神經(jīng)樣細(xì)胞分化培養(yǎng)基的配置: DMEM/F12(1︰1)培養(yǎng)基(Gibco), ES FBS(15%)，Glutamin(100x)，IBMX(1M)，β-mer(1000x)，RA(4mM)；

(4)抗體：

一抗：mouse anti-Synaptophysin (BM0125) abbit anti-nestin(BA0275) 、rabbit anti-GABA(BA0601) 、rabbit anti-Serotonin (BA0121) ； Mouse anti-GFAP (Sigma, G3893), mouse anti-β-tubulin isotypeⅢ (Sigma, T8660), mouse anti-O4(MAB345)；

二抗：標(biāo)記山羊抗兔IgG(ZF0316), FITC 標(biāo)記山羊抗鼠IgG(ZF0312)。

2方法

2.1 小鼠的胚胎干細(xì)胞、豬的ips細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。

得到小鼠胚胎干細(xì)胞系以及豬的ips細(xì)胞系, 接種在飼養(yǎng)層細(xì)胞上。飼養(yǎng)層細(xì)胞經(jīng)γ射線照射滅活有絲分裂活性,接種ES培養(yǎng)基上培養(yǎng), 每天更換培養(yǎng)液。

2.2 擬胚體(EB)培養(yǎng)。

在ES培養(yǎng)皿中加入適量的Tryple(酶)，37℃消化5min，用移液槍吹打細(xì)胞，把細(xì)胞懸浮起來。將細(xì)胞吸入離心管中，1000r離心5min后，再倒掉上清液，用1-2mlEB培養(yǎng)基把細(xì)胞吹起來。再將細(xì)胞加到培養(yǎng)皿中，用分化培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。在培養(yǎng)皿中加入PBS，將每滴懸液滴至平皿上蓋表面，迅速扣在下蓋上，放入培養(yǎng)箱。培養(yǎng)4 d,隔天換液。

2.3 向神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。

收集懸浮培養(yǎng)4 d的EB擬胚體，用已經(jīng)配好的神經(jīng)樣細(xì)胞分化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)4 d,每2 d換液。

2.4 神經(jīng)干細(xì)胞鑒定。

(1)取出培養(yǎng)皿，拋棄培養(yǎng)體系，將培養(yǎng)液吸去，用PBS洗2次；

(2)固定：用4% PPA處理細(xì)胞，在搖床上晃動(dòng)30 min，接著用PBS洗3次， 5 min/次；

(3)對(duì)核表達(dá)的蛋白：0.2% Triton-100于培養(yǎng)皿，在室溫下30 min，接著用PBS洗3次，5 min/次；

(4)加入3% BSA封閉，室溫1 h；

(5)3% BSA稀釋的一抗覆蓋所染部分，室溫1-2h。再用PBS洗上3次，5 min/次；

(6)3%BSA(1:500)稀釋的二抗覆蓋所染部分，室溫1h。棄二抗，PBS洗3次，5 min/次；

(7)加入 1 μg/mL DAPI(1:10000)室溫下2 min。再用PBS洗上3次，5 min/次；

(8)封片：在蓋玻片上加防淬滅劑，避光保存；

(9)利用熒光顯微鏡觀察并拍照，檢測(cè)Nestin、GFAP、tublin的表達(dá)。(免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色法)

3結(jié)果

3.1 豬的iPSCs以及小鼠的ESCs形態(tài)變化過程。

小鼠的ESCs和豬的iPSCs的誘導(dǎo)分化形成NSCs的過程中，形態(tài)上的變化是十分明顯的。從表觀上來看，小鼠的ES細(xì)胞和豬的iPS細(xì)胞形態(tài)上的變化基本是一致的。按照3個(gè)階段進(jìn)行分析：

3.1.1 傳代培養(yǎng)。

復(fù)蘇后第1天，撥開飼養(yǎng)層細(xì)胞，可以觀察到細(xì)胞小、亮、圓,細(xì)胞核大, 核仁明顯，細(xì)胞核/質(zhì)比高。細(xì)胞排列致密, 邊界清晰,呈集落形狀生長(zhǎng)。

復(fù)蘇后第3天, 細(xì)胞克隆進(jìn)一步增大, 中央逐漸突起, 顯微鏡下觀察立體感更強(qiáng), 細(xì)胞排列更緊密。

(a)生長(zhǎng)旺盛的MES細(xì)胞(×40)

(b)生長(zhǎng)旺盛的Pips細(xì)胞(×40)

3.1.2 擬胚體(EB)的形成。

去除飼養(yǎng)層細(xì)胞后，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞能夠逐步地形成擬胚體(EB)。擬胚體(EB)呈球形，胚體飽滿。內(nèi)細(xì)胞間黏附緊密,邊界清楚。

(a)MES的擬胚體 (×40)

(b)Pips的擬胚體 (×40)

3.1.3 誘導(dǎo)分化。

在加入了維甲酸(NA)后，ES細(xì)胞獲得了向某一特定方向誘導(dǎo)分化的趨勢(shì)。

加入了誘導(dǎo)劑后第1天細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，有產(chǎn)生區(qū)域化模式的趨勢(shì)，但不是十分清晰。

加入了誘導(dǎo)劑后3天，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生很大的改變，同時(shí)有細(xì)胞出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。區(qū)域化模式十分明顯，很清晰地看到了同一類型的細(xì)胞逐步靠攏。

3.2 豬iPS細(xì)胞以及小鼠ES細(xì)胞來源的神經(jīng)樣細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志物的鑒定。

免疫熒光結(jié)果顯示誘導(dǎo)7d后的神經(jīng)球樣克隆表達(dá)NSCs標(biāo)志物nestin，貼壁培養(yǎng)后的神經(jīng)球樣克隆表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物β-tubulin III和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP。

小鼠：(a)單層神經(jīng)干細(xì)胞nestin陽性 (×100)

小鼠：(b)β-tubulin III陽性(×100)

小鼠：(c)GFAP陽性(×100)

豬：(d)單層神經(jīng)干細(xì)胞nestin陽性 (×100)

豬：(e)β-tubulin III陽性(×100)

豬：(f)GFAP陽性(×100)

4討論

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)是一種新型的多能干細(xì)胞，具有類似于胚胎干細(xì)胞(ESCs)的特性。所以本實(shí)驗(yàn)借鑒了胚胎干細(xì)胞(ESCs)向神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)誘導(dǎo)分化的方法。目前胚胎干細(xì)胞(ESCs)向神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)誘導(dǎo)分化方法主要有以下幾種: 維甲酸(RA)誘導(dǎo), PA6基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)，生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)，直接分化法。為何選擇維甲酸(RA)進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)基于3個(gè)方面進(jìn)行考慮：

(1)維甲酸(RA)作為一種傳統(tǒng)的分化誘導(dǎo)劑，它可誘導(dǎo)類胚體分化成多種細(xì)胞類型，其分化方向以及程度取決于維甲酸的劑量及作用階段。[10]

(2)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)、PA6基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)這兩種方法涉及的誘導(dǎo)成分過于復(fù)雜，而且對(duì)于培養(yǎng)的要求也是極高的。

(3)直接分化法操作簡(jiǎn)單，效率很高，是現(xiàn)在主流的分化方法。但是，缺少了擬胚體(EB)向神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)過渡這一步，不利于結(jié)果分析。[11]

實(shí)驗(yàn)的過程中，豬的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)在經(jīng)歷傳代培養(yǎng)、擬胚體(EB)的形成、維甲酸(RA)誘導(dǎo)分化以后，得到了懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)球。神經(jīng)球能夠表達(dá)NSCs標(biāo)志物, 這說明豬的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)已經(jīng)分化為NSCs。但是，對(duì)比小鼠的胚胎干細(xì)胞(ESCs)以及豬的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)在分化過程中的區(qū)別還是十分明顯的。分化的第3d，我們?cè)谛∈笊窠?jīng)樣細(xì)胞分化培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)的擬胚體(EB)中央出現(xiàn)特有的環(huán)狀空腔結(jié)構(gòu),我們推測(cè)是神經(jīng)祖細(xì)胞特有的環(huán)狀rosette空腔結(jié)構(gòu)，一種類似于早期的神經(jīng)管結(jié)構(gòu)。[12]但是，豬的胚胎干細(xì)胞(ESCs)卻沒有出現(xiàn)這種rosette空腔結(jié)構(gòu)。

雖然我們最終得到了神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)，但是我們并沒有檢測(cè)分化最終的效率，這是實(shí)驗(yàn)的一個(gè)遺憾之處。如果要進(jìn)行更加深入的實(shí)驗(yàn)，我們有必要對(duì)于這種分化方法的效率進(jìn)行探索?，F(xiàn)在主流的檢測(cè)分化效率的方法：RNA的分離和定量PCR分析——首先使用RNeasy Mini Kit這種提取試劑盒去實(shí)現(xiàn)對(duì)這個(gè)體系中所有細(xì)胞RNA的提取，再利用SuperScript III第一鏈合成系統(tǒng)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到細(xì)胞的互補(bǔ)DNA(cDNA)。在完成這些準(zhǔn)備工作后，我們?cè)倮肧YBR Green mix對(duì)cDNA進(jìn)行染色，最終可以利用Roche LightCycler 5480等儀器進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。[13]

經(jīng)過以上的研究表明，通過誘導(dǎo)分化傳統(tǒng)的方法即通過擬胚體的形成并添加RA進(jìn)行誘導(dǎo)，的確可以使得豬的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)形成神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)。但是，這得到的僅僅是初步的結(jié)果，至于得到的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)是否具有終末分化能力、是否有成瘤性、能否發(fā)揮相應(yīng)的功能等, 都需要進(jìn)一步深入研究。

5展望

隨著iPS細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，人們逐步建立起了家畜類動(dòng)物的iPS細(xì)胞系，如豬、綿羊。對(duì)于家畜類動(dòng)物而言，iPS細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)為這些很難建立ES細(xì)胞系的物種建立多能干細(xì)胞系帶來了希望。因?yàn)榧倚箢悇?dòng)物ES細(xì)胞系長(zhǎng)期培養(yǎng)后易出現(xiàn)分化現(xiàn)象，所以建立的ES細(xì)胞系難度大。如果成功建立家畜iPS細(xì)胞系，利用其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，將iPS細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)與相關(guān)技術(shù)相結(jié)合，如嵌合體技術(shù)，在家畜動(dòng)物的異種器官移植、品種改良以及人源性疾病動(dòng)物模型的制作[14]等方面都具有廣闊的開發(fā)前景。

雖然部分家畜類動(dòng)物的iPS細(xì)胞系得到了建立，但是依舊存在很多不足。由于iPS細(xì)胞是通過體外重新編碼形成的，即使豬作為最早建立iPS細(xì)胞系的家畜類動(dòng)物，依舊很難確定重新編碼的基因是否繼續(xù)表達(dá)從而能使得細(xì)胞定向分化的過程變得復(fù)雜化。比如豬ID6細(xì)胞系[15]已被用于產(chǎn)生視網(wǎng)膜前體細(xì)胞，可以用來恢復(fù)視網(wǎng)膜的能力。[16]但是通過使用誘導(dǎo)人類ES細(xì)胞系的方法，在驅(qū)動(dòng)豬ID6細(xì)胞系定向分化的過程中很難出現(xiàn)內(nèi)胚層或中胚層細(xì)胞。這與各大實(shí)驗(yàn)室得到的結(jié)論：由iPSC形成的擬胚體中必定存在這樣的結(jié)構(gòu)，相違背。[17]

實(shí)驗(yàn)表明,通過在神經(jīng)退行性疾病動(dòng)物模型中移植神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs),神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)可以通過分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Neurotrophin，NT)，如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve Growth Factor, NGF)、腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)等，保護(hù)神經(jīng)元并引起神經(jīng)再生效應(yīng)。[18]Parkinson可見神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)在臨床治療方面具有很大的開發(fā)價(jià)值。隨著iPS細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)定向誘導(dǎo)分化成神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)必將成為神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的主要來源。

2014年，一名罹患退行性眼病的日本患者成為全球使用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)進(jìn)行治療的第一人，[19]這意味著通過iPS技術(shù)所代表的克隆技術(shù)治療人類疾病的設(shè)想將首次付諸實(shí)踐。雖然還需要后續(xù)的研究，才能確定這一實(shí)踐的最終效果，但是不可否認(rèn)這是一步很大的跨越，為干細(xì)胞療法的臨床實(shí)踐打開了一個(gè)新的篇章。由于iPS細(xì)胞系的建立方式以及遺傳穩(wěn)定性依然存在著很多不確定性的因素，iPS細(xì)胞技術(shù)還需要更深入研究和探索。

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Inducing Porcine iPS Cells into Neural Stem Cellsinvitro

Zhang Ding，Zhang Xiaoshan，Wang Yi

(School of Biological Sciences, China Agriculture University, Beijing 10094, China)

Abstract：The major objective of our study is to induce porcine iPS cells into neural stem cells in vitro. During the whole process of experimental exploration, we induced porcine iPS cells into neural stem cells by using a traditional method: inducing embryoid body(EB) into neural stem cells by adding Retinoic acid(RA) in vitro. Porcine iPSCs underwnet subculture、embryoid body(EB)、inducing differentiation three important stages to form another kind of cells.Finally，we validated the newly formed cell is neural stem cells by using immunofluorescence assay to detect the neural stem cell specific marker Nestin、the neuronal marker β- tubulin III and glial cell marker GFAP in the new formed cell. As a result, porcine iPSCs induced by this traditional method can successfully induced into neural stem cells and express nestin.

Key words：pig；iPS cells；neural stem cells(NSCs)；induceinvitro

Class No.:Q28Document Mark：A

(責(zé)任編輯：宋瑞斌)