陳軍寶 綜述 肖 苒 曹 誼 林審校

·綜述·

miRNA在間充質干細胞成骨分化過程中的作用

陳軍寶 綜述 肖 苒 曹 誼 林審校

間充質干細胞作為種子細胞在組織工程和再生醫(yī)學領域有極大的應用前景，尤其是在骨組織工程中的應用受到了廣泛關注。間充質干細胞的成骨分化機制復雜，受到多方面因素的影響，不同種類的miRNA可分別參與抑制或促進間充質干細胞的成骨分化，在其分化過程中具有核心作用。本文對不同作用的miRNA進行歸類和總結，期待為未來的研究提供思路。

間充質干細胞微小核糖核酸成骨分化信號通路

間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）作為干細胞家族的重要成員，可分離自骨髓、脂肪、骨骼肌、滑膜、臍帶及臍帶血等組織，因其具有多向分化、自我復制、造血支持、免疫調控等特點，在干細胞治療、基因治療、組織工程和再生醫(yī)學等領域有重要的應用價值[1-2]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸（MicroRNA，miRNA）可通過調控靶基因的表達，參與調節(jié)干細胞的各種生物學功能，尤其是在MSCs成骨分化與成熟過程中的作用日益受到重視[3]。本文就miRNA在間充質干細胞成骨分化過程中的調節(jié)作用進行綜述。

1 miRNA簡介

miRNA是一類長度為20～24 bp的非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于動植物、真菌等各類生物體內，主要通過調控基因表達參與多種病理生理過程。1993年，Lee等[4]在研究秀麗隱桿線蟲突變表型時首次發(fā)現(xiàn)miRNA，迄今已發(fā)現(xiàn)了千余種miRNA，現(xiàn)已明確其參與多種細胞生物學過程，如細胞增殖、凋亡、分化、代謝、氧化應激等[5]。

2 miRNA與MSCs的成骨分化的關系

miRNA在間充質干細胞成骨分化過程中具有核心作用，通過對信號通路中不同水平的關鍵分子的調節(jié)，構成間充質干細胞成骨分化的調控網(wǎng)絡，從而達到對干細胞成骨的精確調控。Zhang等[6]發(fā)現(xiàn)，在用抗壞血酸（50 μg/mL）誘導的大鼠MC3T3-E1成骨細胞系和MLO-A5成骨前體細胞系成骨分化過程中，MC3T3-E1成骨細胞系中有51種miRNA的表達量發(fā)生顯著改變，其中有31種miRNA的表達減少；在MLO-A5成骨前體細胞系中有20種miRNA的表達量發(fā)生顯著改變，其中有6種miRNA的表達減少。研究證實了不同種類的miRNA可通過其靶基因作用于經(jīng)典Wnt信號通路，而調控MSCs的成骨分化。Wang等[7]將置于PHBHHx帶溝槽材料上的大鼠骨髓來源的MSCs細胞培養(yǎng)72 h后，與在滑面PHBHHx材料上培養(yǎng)的MSCs相比較，分析miRNA的表達譜，發(fā)現(xiàn)有18種miRNA出現(xiàn)差異性的表達，其中14種miRNA的表達量明顯上調（包括miR-140，miR-210，miR-214等），4種miRNA表達明顯下調（包括let-7a，let-7i，miR-146a，miR-196a），進一步將差異性表達的miRNAs與其靶基因的作用進行分析，發(fā)現(xiàn)MSCs成骨分化成熟主要與MAPK、Smad信號通路相關，其中miR-93、miR-214、miR-324-3p、miR-503、miR-674-5p通過其相應的作用靶點調控MAPK信號通路，而miR-93、miR-503、miR-140、miR-298、miR-146a、miR-351則主要調控Smad信號通路。miRNA在MSCs成骨細胞分化過程中的調控信號網(wǎng)絡復雜，是研究的難點。

3 MSCs成骨分化的影響因素

MSCs的成骨分化成熟過程受多種因素的影響，包括種子細胞的來源、分離純化方式、誘導分化策略、血管化進程等[8]。Guillot等[9]對胎兒骨髓、外周血、肝臟3種不同組織來源的MSCs的分化能力進行比較，發(fā)現(xiàn)骨髓來源的MSCs成骨分化能力最強，肝臟來源的MSCs成骨分化能力最弱。其他因素，如細胞生長的微環(huán)境、支架材料、生物力學信號等，也會對MSCs的成骨分化成熟產(chǎn)生影響。

4 miRNA在MSCs的成骨分化過程中的作用

miRNA通過與靶基因mRNA的相互作用來調節(jié)MSCs成骨分化過程中的轉錄因子、信號分子及其相對應的受體的功能。不同種類的miRNA可分別參與調節(jié)TGF-β、MAPK、PI3K、Wnt、Notch等多條細胞信號轉導通路，調控MSCs的分化及成熟[10]。

4.1 促進成骨分化

Zhou等[11]用伊班磷酸鹽處理牙周膜間充質干細胞，其miRNA-18a的表達量明顯升高，提示miRNA-18a可能參與伊班磷酸鹽誘導的牙周膜間充質干細胞向成骨細胞分化的過程。Liu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，來源于牙周炎患者的牙周膜間充質干細胞成骨分化能力明顯降低，其機制是炎癥因子IL-1β和TNF-α可上調Smurfl的表達水平，而Smuffl可負性調控MSCs的成骨分化，miRNA-17能通過抑制Smuffl的表達，從而促進牙周膜中MSCs的成骨分化。Huang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在人脂肪來源的間充質干細胞向成骨細胞分化的過程中，miRNA-22及其靶基因HDAC6是MSCs向成骨分化的重要調節(jié)因子，高表達的miRNA-22通過抑制HDAC6的水平，從而促進成骨細胞的生成，同時還可抑制脂肪組織的形成。Li等[14]發(fā)現(xiàn)miRNA-26a能促進VEGF的分泌，調節(jié)骨髓來源的MSCs的成骨分化和血管形成過程，體內實驗研究發(fā)現(xiàn)在骨骼缺損的周圍組織中miRNA-26a的表達水平增高，骨組織的再生能力和血管化能力明顯增強。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在間充質干細胞系hFOBl.19細胞向成骨細胞分化的過程中，miRNA-27的表達量在其分化的第12小時開始增加，在分化的第72小時明顯增加，和對照組相比差異有統(tǒng)計學意義，他們還證實miRNA-27的水平與β-連環(huán)蛋白表達量呈正相關，β-連環(huán)蛋白可與結腸腺瘤性息肉?。ˋdenomatous polyposis coli，APC）蛋白形成復合物而發(fā)生降解，miRNA-27可直接抑制APC基因的表達，減少細胞內信號分子β-連環(huán)蛋白的降解，最后細胞內不斷累積的β-連環(huán)蛋白可激活經(jīng)典Wnt信號通路，促進hFOBl.19細胞向成骨分化成熟。Hu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，hFOBl.19細胞向成骨細胞分化的過程中，miRNA-142-3p表達增多，抑制miRNA-142-3p的表達則對hFOBl.19細胞的成骨分化有抑制作用，其機制也可能與miRNA-142-3p抑制APC基因的蛋白表達，激活Wnt信號通路有關。Suh等[17]發(fā)現(xiàn)，miRNA-29b促進hMSCs的成骨分化成熟，還干擾成骨分化的負向調控基因（如：HDAC4、CTNNBIP1、DUSP2等），而間接促進骨的生成，這些基因可分別通過Smads、ERK、Wnt等信號通路，影響間充質干細胞的成骨分化。Hassan等[18]發(fā)現(xiàn)，miRNA-218能夠促進骨髓間充質干細胞定向分化為成骨細胞，其機制是miRNA-218能夠抑制DKK2、SFRP2、SOST等Wnt信號通路的負性調控因子，間接激活Wnt信號通路。因此，miRNA-218與Wnt信號通路形成的正反饋可促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞的分化。Bhushan等[19]將骨形態(tài)生成蛋白-2/6（BMP2/6）誘導小鼠C2C12和MC3T3細胞成骨分化，在細胞分化24 h后，可檢測到miRNA-181a表達量明顯增加，發(fā)現(xiàn)miR-181a可直接作用于Tgfbi和TβR-I靶點，通過調節(jié)TGF-β和Wnt信號轉導通路，促進C2C12和MC3T3細胞的成骨分化進程。

4.2 抑制成骨分化

Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-17家族成員（主要是miRNA-17-5p和miRNA-106a）可抑制脂肪來源的間充質干細胞（hADSCs）向成骨分化，但可促進其向脂肪組織的分化成熟。發(fā)現(xiàn)hADSCs在向成骨細胞分化的過程中，BMP-2、TAZ和MSX2的mRNA表達水平在分化的第4天達到峰值，然后逐漸降低。BMP2（TGFβ/BMPs信號通路成員）作為miRNA-17-5p和miRNA-106a的作用靶點，參與調節(jié)骨的發(fā)生、骨骼形成和骨折愈合，miRNA-17-5p和/或miRNA-106a可抑制BMP2的表達水平，干預hADSCs的成骨分化。Zeng等[21]證實，在hADSCs向成骨細胞分化的過程中，抑制miRNA-100的功能可增加BMPR2的表達，其機制是BMPs與BMPR2的結合后可激活BMPR1，進而使胞內的Smads信號分子發(fā)生磷酸化，抑制成骨細胞的分化成熟。Wei等[22]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-34家族成員（miRNA-34b和miRNA-34c）可以通過抑制核基質蛋白SATB2的表達，從而抑制小鼠成骨細胞的分化成熟，并且能通過減少CDK4、CDK6和CyclinD1的蛋白積累，抑制成骨細胞的增殖。Yang等[23]證實，在小鼠原代成骨細胞的體外礦化過程中，miRNA-93的表達量明顯降低，miRNA-93的靶基因直接作用位點在轉錄因子Sp7的編碼區(qū)內。他們發(fā)現(xiàn)，Sp7作為成骨細胞礦化過程的關鍵分子，高表達的Sp7可以與miRNA-93的啟動子區(qū)結合抑制其轉錄，從而抑制成骨細胞的礦化進程。Mizuno等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在BMP4誘導的小鼠間充質干細胞（ST2細胞）向成骨細胞分化的過程中，ST2細胞內高表達的miRNA-125b可直接作用于其靶基因ErbB2，在ST2細胞分化的早期抑制細胞的增殖和成骨分化。Eskildsen等[25]證實，miRNA-138可通過抑制FAK蛋白表達來調節(jié)人骨髓來源的間充質干細胞的成骨分化，過度表達的miRNA-138使FAK蛋白的磷酸化減弱，影響FAK下游信號的轉導；破壞miRNA-138的功能后，F(xiàn)AK蛋白的磷酸化增強，可激活其下游的ERK1/2信號通路，使Runx2發(fā)生磷酸化，增強Osterix的表達，促進細胞的成骨分化。TNF-α可通過上調miR-155的表達，以抑制BMP-2誘導的MC3T3-E1細胞的成骨分化，TNF-α可能通過激活SAPK/JNK信號通路抑制BMP-2誘導的成骨分化[26]。Tome等[27]證實，高表達的miRNA-335可破壞間充質干細胞的增殖、遷移和分化，且Wnt3a信號可以正向調節(jié)miR-335的表達，從而抑制間充質干細胞的成骨分化和增殖；IFN-γ的作用與Wnt3a相反，可以負向調節(jié)miRNA-335的表達，促進細胞的成骨分化成熟。研究發(fā)現(xiàn)，ERRγ可促進miRNA-433在小鼠骨源性間充質干細胞譜系C3H10T1/2細胞中的表達，而在BMP-2誘導的細胞成骨分化過程中，ERRγ和miR-433的表達量均減少。此外，在C3H10T1/2細胞成骨分化的過程中，高表達的ERRγ和miR-433可抑制成骨分化標志基因Runx2和ALP的表達，說明miR-433可負向調控C3H10T1/2細胞的成骨分化成熟[28]。

5 展望

間充質干細胞是組織工程成骨種子細胞的重要來源，在骨缺損修復與再造領域具有廣闊的應用前景。miRNA作為調控間充質干細胞向成骨細胞分化的關鍵調控因子之一，在間充質干細胞向成骨細胞分化及成熟過程中的作用機制尚未完全闡明，miRNA靶基因的功能特異性、miRNA之間的相互作用，以及環(huán)境因素的作用影響等，是未來研究的重點。隨著研究的不斷深入，間充質干細胞向成骨細胞的分化機制會不斷被闡明，從而為骨組織工程提供新的理論基礎和實驗依據(jù)。

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Role of MicroRNA in the Process of Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells

CHEN Junbao1,XIAO Ran2,CAO Yilin2.1 The Fifth Department;2 Research Center,Plastic Surgery Hospital of Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College,Beijing 100144,China.Corresponding author:CAO Yilin(E-mail:yilincao@yahoo.com).

Mesenchymal stem cells;MicroRNA;Osteogenic differentiation;Signal pathway

Q813.1+1

B

1673－0364（2016）06－0375－03

2016年3月12日；

2016年5月5日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.06.013

100144北京市中國醫(yī)學科學院整形外科醫(yī)院整形五科（陳軍寶）；100144北京市中國醫(yī)學科學院整形外科醫(yī)院研究中心（肖苒，曹誼林）。

曹誼林（E-mail：yilincao@yahoo.com）。

【Summary】Mesenchymal stem cells have great application prospects in tissue engineering and regenerative medicine as seed cells,especially have evoked the extensive attention in the application of bone tissue engineering.Mechanisms of osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells are complicated.It is affected by various factors.Different kinds of miRNA can inhibit or promote the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells respectively,it plays a key role in the differentiation process.In this paper,miRNA in different roles was classified and summarized,expecting to provide ideas for future research.