畢相東 張興華 宋 倫 胡順鑫 唐學(xué)璽① 閆 冉

(1. 天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室 天津 300384; 2. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 青島 266003;3. 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院 大連 116023; 4. 南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 天津 300350)

自2009年起已連續(xù)5年在河北省秦皇島近岸海域定期(5—8月)暴發(fā)“褐色赤潮”(國家海洋局,2010—2014), 2011年起山東半島威海海域亦有“褐色赤潮”暴發(fā)(劉愛英等, 2013)。秦皇島近岸海域乃至我國北方其它沿海暴發(fā)如此大范圍的“褐色赤潮”對我國貝類養(yǎng)殖業(yè)造成極大的損失。渤海秦皇島近岸海域是我國最大的海灣扇貝養(yǎng)殖區(qū), 2009年褐色赤潮暴發(fā)期間當(dāng)?shù)亟?/3的海灣扇貝養(yǎng)殖區(qū)約1733 hm2養(yǎng)殖貝類受到影響, 扇貝出現(xiàn)了生長停滯和死亡的現(xiàn)象(廖洋等, 2012)。根據(jù)國家海洋局海洋災(zāi)害公報報道,2010年河北沿?！俺喑薄?現(xiàn)已證實為主要為褐潮)面積達3350 km2, 直接經(jīng)濟損失2.05億元(國家海洋局,2010-2014)。該褐色赤潮每年5月中下旬至6月上旬在渤海海域定期出現(xiàn), 海水透明度降低常呈黃褐色,形成的藻華一般到8月中下旬才會慢慢消去, 主要原因種是細胞直徑只有2—3 μm的微微型藻, 藻華發(fā)生時該藻細胞密度最高可達到 109cell/L (Kong et al,2012)。中國科學(xué)院海洋研究所于仁成研究團隊采用光合色素分析和特異性抗體檢測等手段研究表明,渤海近岸海域有害藻華的主要原因種為海金藻類的抑食金球藻(Aureococcus anophagefferens) (Kong et al,2012)。抑食金球藻能產(chǎn)生一種類似多巴胺的生物活性物質(zhì)(Sieburth et al, 1988; Zhang et al, 2012), 能抑制貝類側(cè)纖毛的活動, 從而對濾食性貝類產(chǎn)生負面影響, 具體表現(xiàn)為抑制貝類的攝食、生長、甚至導(dǎo)致死亡(Bricelj et al, 1997; Bricelj et al, 2001)。因藻華期間細胞密度極高、能特異性地抑制貝類攝食、藻華水體呈黃褐色而被稱作“褐潮”, 該命名已被國際有害藻華研究界所接受。至此, 我國是繼美國(Cosper et al,1987)及南非(Probyn et al, 2001)后第三個發(fā)生褐潮的國家。

目前, 褐潮的危害在我國近岸海域不斷地擴大發(fā)展, 亟需建立有效的褐潮應(yīng)急處置技術(shù), 以期大幅降低其對近岸貝類養(yǎng)殖的危害。研究人員嘗試采用粘土吸附藻細胞等物理方式(張雅琪等, 2013)及H2O2抑殺藻細胞等化學(xué)方法進行消除(Randhawa et al,2012)。但終因耗費高、生態(tài)安全性低等諸多局限, 均未規(guī)模化地應(yīng)用于貝類養(yǎng)殖海域的褐潮應(yīng)急處置中。最近興起的利用植物間競爭作用或化感作用抑制有害藻類生長的生物控藻技術(shù)頗受關(guān)注, 被認為是高效、生態(tài)安全性好的新型控藻技術(shù)(楊小茹等, 2008)。畢相東等(2016)研發(fā)出一種餌料微藻濃縮液緩釋儀,使用篩選出的既能強烈抑制抑食金球藻生長又能為養(yǎng)殖微環(huán)境中貝類提供餌料的微藻, 并將其濃縮液緩釋于貝類養(yǎng)殖的微環(huán)境中。該技術(shù)將能夠有效降低對褐潮對貝類養(yǎng)殖的危害, 提高養(yǎng)殖經(jīng)濟效益, 具有廣闊的實用推廣前景。

小球藻(Chlorella vulgaris)是最為常見的貝類餌料微藻, 具有生長快、細胞活性高、競爭力強等特點。研究發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系中的小球藻對赤潮異灣藻(Heterosigma akashiwo)的生長具有強烈的抑制作用(王金鳳, 2007)。本研究采用抑食金球藻的熒光定量PCR監(jiān)測技術(shù)(宋林生等, 2013), 詳細分析了共培養(yǎng)體系中小球藻與抑食金球藻的相互作用, 并在此基礎(chǔ)上通過分析小球藻培養(yǎng)濾液對抑食金球藻生長和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響, 探討小球藻與抑食金球藻間的相互作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗藻種

抑食金球藻(Aureococcus anophagefferens CCMP1984)來自美國國家海洋浮游植物藻種中心(National Center for Marine Algae and Microbiota, NCMA), 小球藻(Chlorella vulgaris)來自中國海洋大學(xué)生態(tài)學(xué)實驗室藻種庫。

1.2 培養(yǎng)條件

實驗用三角瓶預(yù)先用1mol/L的HCl浸泡24h, 蒸餾水反復(fù)沖洗干凈后, 于121°C滅菌20min。培養(yǎng)用的海水均為取自青島市魯迅公園的自然海水, 經(jīng)沉淀、脫脂棉過濾、0.22μm微孔濾膜抽濾后, 于121°C滅菌 20min。本實驗均采用一次性培養(yǎng)的方法, 在250mL的三角瓶中進行, 培養(yǎng)液體積為150mL。所有實驗藻種均用f/2營養(yǎng)鹽配方培養(yǎng), 溫度(20±1)°C, 光照 60μmol/(m2·s), 光暗周期 12h : 12h, 每天搖動藻液3—4次, 防止藻細胞附壁下沉。

1.3 藻細胞的計數(shù)方法

小球藻和單養(yǎng)培養(yǎng)體系中抑食金球藻的計數(shù)方法: 取搖晃均勻的微藻培養(yǎng)液 0.5mL, 用 Lugol碘液固定后血球計數(shù)板計數(shù)。

共培養(yǎng)體系中抑食金球藻的計數(shù)方法: 由于抑食金球藻細胞微小直徑只有 2—3μm, 在共同培養(yǎng)體系中顯微計數(shù)易受其它藻種和雜質(zhì)的影響而導(dǎo)致計數(shù)失準(zhǔn)。因此, 本實驗中共同培養(yǎng)體系中抑食金球藻采用宋林生等(2013)研發(fā)的熒光定量 PCR技術(shù)進行計數(shù)。該方法原理為利用抑食金球藻基因組中具有較高特異性的單拷貝基因脲基甲酸酯水解酶基因, 以該基因的序列設(shè)計特異性的引物和探針, 利用熒光定量 PCR技術(shù)建立一種快速檢測抑食金球藻細胞密度的方法。本研究參照該方法, 繪制藻細胞數(shù)量與Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程。然后, 實驗中每 2天取 1mL藻液, 經(jīng) 0.45μm 的纖維素濾膜過濾來獲取藻細胞,收集藻液的 0.45μm的濾膜作為提取 DNA的介質(zhì)。將提取的 DNA樣品進行熒光定量 PCR, 獲得 Ct值,將其代入已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中并換算出藻細胞數(shù)量。每個樣品設(shè)3個平行, 計算平均值。

1.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

用德國Walz公司產(chǎn)Phyto-PAM進行各葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定。取2 mL藻液經(jīng)15 min暗適應(yīng)后, 打開測量光, 待Ft熒光穩(wěn)定后, 施加200 ms 的飽和脈沖, 得到F0、Fm及Fv/Fm的值。另取2mL藻液, 施加164 μmol/(m2s)的光化光 2 min 后, 施加 200 ms的飽和脈沖, 得到F′、Fm′及 ΦPSII的值。

另取2 mL藻液, 測定快速光曲線(RLC)(Ralph et al, 2005)。光強梯度設(shè)置為: 1, 16, 32, 64, 164, 264,364, 464, 664, 864, 1064, 1264, 1464, 1664, 1864和2064 μmol/(m2s), 通過軟件內(nèi)置公式擬合, 得到alpha(到達光飽和之前RLC的初始斜率)、rETRmax(最大相對電子傳遞速率)和Ik(半飽和光強)的估計值。

1.5 實驗內(nèi)容

1.5.1 抑食金球藻熒光定量PCR監(jiān)測技術(shù)的建立

(1) 藻細胞的收集及基因組 DNA提取: 在光學(xué)顯微鏡下記錄穩(wěn)定期藻細胞密度后稀釋, 使藻細胞密度最終分別達到為 8, 8×101, 8×102, 8×103, 8×104,8×105, 8×106cell/ mL, 經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜過濾來獲取微藻細胞, 收集藻液的 0.45 μm 濾膜作為基因組DNA提取介質(zhì)。藻細胞基因組DNA提取所用的試劑盒為TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0。提取流程按照試劑盒說明進行。

(2) 特異性熒光探針定量 PCR反應(yīng)(宋林生等,2013)

上游引物 5′-GCGGAGGTCGTGGAGAGG-3′

下游引物 5′-GGGTGCGTCCGTAGACTTGA-3′

探針 5′-CTCGGCTTCACGGGCGGCTTCC-3′

反應(yīng)體系: 基因組DNA模板約4 μL、2×Premix EX Taq BufferMix (TaKaRa) 5 μL、探針 0.4 μL(10 μmol/L)、引物各 0.2 μL(10 μmol/L), 最后加滅菌去離子水至 10 μL。

反應(yīng)條件: 95°C 預(yù)變性10 min, 95 °C變性15 s,60 °C退火/延伸1 min, 40個循環(huán)。

藻細胞基因組DNA樣品在ABI 7500熒光定量PCR儀上進行擴增和數(shù)據(jù)分析。

(3) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

將特異性熒光探針定量PCR反應(yīng)所得的Ct值與細胞的對數(shù)值通過線性回歸擬合形成標(biāo)準(zhǔn)曲線, 并得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.5.2 抑食金球藻的單培養(yǎng)實驗 將處于指數(shù)增長期的抑食金球藻接進行接種, 使其起始密度分別達到(1, 2, 4)×104cell/mL, 在藻種室培養(yǎng)。每實驗設(shè)3個平行組, 每d取出藻液按1.3中所述方法對藻細胞進行計數(shù)。

1.5.3 小球藻和抑食金球藻的共培養(yǎng)實驗 小球藻(C. vulgaris)簡稱C、抑食金球藻(A. anophagefferens)簡稱 A, 具體設(shè)置如下: 處理①: 共培養(yǎng)體系中小球藻的起始密度為1×104cell/mL、抑食金球藻的起始密度為4×104cell/mL, 初始密度比C︰A = 1︰4。處理②: 共培養(yǎng)體系中小球藻的起始密度為2×104cell/mL、抑食金球藻的起始密度為2×104cell/mL, 初始密度比C︰A = 1︰1。處理③: 共培養(yǎng)體系中小球藻的起始密度為 4×104cell/mL, 抑食金球藻的起始密度為 1×104cell/mL、初始密度比C︰A = 4︰1。

將處于指數(shù)增長期的抑食金球藻和小球藻按上述接種比例共同培養(yǎng)(小球藻的比例逐漸增加), 實驗以相同條件下單培養(yǎng)實驗中的抑食金球藻作為對照,每實驗設(shè)3個平行。自接種之后起, 每2 d取出藻液按1.3中所述方法對兩種藻細胞進行計數(shù)。

1.5.4 小球藻培養(yǎng)濾液對抑食金球藻生長及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響實驗 為初步研究小球藻對抑食金球藻生長抑制的作用機理, 開展了小球藻培養(yǎng)濾液對抑食金球藻生長及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響研究。將處于對數(shù)增長期、起始密度為5×104cell/mL的小球藻進行培養(yǎng), 使其達到最大環(huán)境容量; 溶液經(jīng)0.22μm 的醋酸纖維素濾膜抽濾, 該溶液即為小球藻的培養(yǎng)液濾液。實驗分6組, 每組加入不同量的小球藻培養(yǎng)濾液, 具體設(shè)置為: 組① 140mL海水+0mL小球藻培養(yǎng)濾液; 組② 135mL海水+5mL小球藻培養(yǎng)濾液; 組③ 130mL海水+10mL小球藻培養(yǎng)濾液; 組④120mL 海水+20mL小球藻培養(yǎng)濾液; 組 ⑤ 1 05mL 海水+35mL小球藻培養(yǎng)濾液; 組 ⑥ 9 0mL 海水+50mL小球藻培養(yǎng)濾液。以組①為空白對照, 每組設(shè)3個平行,按比例加入 f/2營養(yǎng)鹽后, 接入 10mL處于指數(shù)增長期的抑食金球藻, 最后的實驗總體積均為150mL。自接種之后起, 每天同一時間取出藻液, 按 1.3中所述方法對抑食金球藻細胞進行計數(shù), 按1.4中所描述的方法進行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定。

1.6 數(shù)據(jù)分析

1.6.1 種群瞬時增長率、環(huán)境容量和生長曲線進入拐點時間的計算 利用Logistic方程對微藻種群的增長進行擬合, 并根據(jù)其積分形式N=K/(1+e(a-rt))用統(tǒng)計軟件 SigmaPlot 12.5進行非線性回歸分析, 計算環(huán)境容量(K)和種群瞬時增長率(r), 式中 a表示曲線對原點的相對位置, 其值取決于N0, N0=K/(1+ea), t表示時間。根據(jù)公式Tp=a/r計算藻類生長曲線到達拐點的時間。

1.6.2 統(tǒng)計分析 采用Excel 2010作圖。采用SPSS 17.0進行單因子方差分析和多重比較。P＜0.05被認為是在α=0.05水平上差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

從圖1可以看出, 熒光定量PCR擴增曲線平滑,擴增效果較好。根據(jù)藻細胞DNA模板PCR擴增后所得的Ct值與藻細胞數(shù)目的對數(shù)值通過線性回歸擬合形成如下標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖 2, 線性回歸方程為y=–2.6711x+ 42.134, 相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9519, 顯示出良好的線性關(guān)系, 且有較寬藻細胞數(shù)目檢測范圍, 完全可適用于本實驗中抑食金球藻細胞數(shù)目的定量分析。

2.2 單培養(yǎng)體系中抑食金球藻的生長情況

單培養(yǎng)體系中不同起始密度抑食金球藻的生長情況見圖3。從圖3可以看出, 不同起始密度抑食金球藻的生長曲線均呈現(xiàn)出典型的Logistic “S”型增長模式。以邏輯斯諦方程進行擬合, 各參數(shù)的估計值以及生長曲線達到拐點的時間見表 1。結(jié)果表明隨著起始密度的增加, 抑食金球藻種群K值逐漸減小, 進入指數(shù)生長期和靜止期的時間亦逐漸縮短, 而種群瞬時增長率(r)、進入拐點時間(Tp)及穩(wěn)定期細胞密度均較為接近。

圖1 PCR檢測出熒光定量樣品ΔRn和循環(huán)數(shù)的擴增曲線Fig.1 Amplification of standards from qPCR run on ABI7500 of ΔRn versus the number of cycles

圖2 抑食金球藻密度對數(shù)值與Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of threshold cycle (Ct) versus the abundance of A. anophagefferens (cells/mL) in log scale

圖3 不同起始密度下抑食金球藻的生長曲線Fig.3 The growth curve of A. anophageferens under differential initial densities

表1 不同起始密度下抑食金球藻的生長參數(shù)的比較Tab.1 The growth parameters of A. anophagefferens population at different initial cell densities

2.3 共培養(yǎng)實驗兩種藻細胞的生長比較

2.3.1 處理①中兩種藻的生長比較 當(dāng) C︰A=1︰4時, 小球藻和抑食金球藻的生長情況見圖 4。小球藻從第4天起進入指數(shù)生長期, 在第 18天時種群密度達到1775 × 104cell/mL; 而抑食金球藻自接種起種群一直處于緩慢的增長狀態(tài), 一直未出現(xiàn)指數(shù)性的增長, 在第16天進入穩(wěn)定期后細胞密度維持在235×104cell/mL, 僅為對照組K值的4.58%。實驗結(jié)束時共培養(yǎng)體系中抑食金球藻細胞數(shù)目與對照組相比有著顯著性差異(P＜0.05)。

圖4 初始接種密度比C:A=1:4條件下小球藻和抑食金球藻的種群生長情況Fig.4 The population growth of C. vulgaris and A.anophageferens when the initial density proportion C:A=1:4

2.3.2 處理②中兩種藻的生長比較 當(dāng) C:A=1:1時, 小球藻和抑食金球藻的生長情況見圖 4。小球藻從第 3天起進入指數(shù)生長期, 在第18天時種群密度達到 1923×104cell/mL; 與小球藻相比抑食金球藻生長滯緩, 抑食金球藻的生長未出現(xiàn)明顯的指數(shù)增長期和靜止期。抑食金球藻的環(huán)境容量(K值)為160.667×104cell/mL, 僅為對照組K值的3.44%, 最后細胞密度維持在90×104cell/mL左右。實驗結(jié)束時共培養(yǎng)體系中抑食金球藻細胞數(shù)目與對照組相比有著顯著的差異(P＜0.05)。

2.3.3 處理③中兩種藻的生長比較 在本處理組中, 抑食金球藻和小球藻的生長情況如圖6所示。共培養(yǎng)體系中, 小球藻從第2天起進入指數(shù)生長期, 在第18天種群密度達到2123.75×104cell/mL, 生長未受到明顯的影響。與小球藻相比, 共培養(yǎng)體系中抑食金球藻的生長受到了明顯的抑制。抑食金球藻的生長未出現(xiàn)明顯的指數(shù)增長期和靜止期。環(huán)境容量(K值)為117×104cell/mL, 僅約為對照組K值的 2.51%, 最后細胞密度維持在80×104cell/mL左右。實驗結(jié)束時共培養(yǎng)體系中抑食金球藻細胞數(shù)目與對照組相比有著顯著的差異(P＜0.05)。

圖5 初始接種密度比C:A=1:1條件下小球藻和抑食金球藻的種群生長情況Fig.5 The population growth of C. vulgaris and A. anophageferens when the initial density proportion C: A=1:1

圖6 初始接種密度比C:A=4:1條件下小球藻和抑食金球藻的種群生長情況Fig.6 The population growth of C. vulgaris and A.anophageferens when the initial density proportion C:A= 4:1

2.4 小球藻培養(yǎng)濾液對抑食金球藻的生長及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.4.1 小球藻培養(yǎng)濾液對抑食金球藻細胞密度的影響 加入不同量的小球藻培養(yǎng)濾液后對抑食金球藻細胞生長的影響見圖7(A)。加入5mL小球藻培養(yǎng)濾液(②組)對抑食金球藻的生長并未產(chǎn)生明顯影響,隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加, ①、②組細胞密度逐漸增加,1—7 d內(nèi)與對照組(①)相比細胞密度均無顯著性差異;加入10mL小球藻培養(yǎng)濾液的③組細胞密度先減少后增加, 培養(yǎng)結(jié)束時細胞密度明顯低于對照組, 細胞的生長受到了顯著的抑制作用(P＜0.05); 分別加入20、35、50 mL小球藻培養(yǎng)濾液的④、⑤、⑥組細胞密度并未增加, 而是逐漸減少至較低水平(＜5×104cell/mL),抑食金球藻的藻的生長受到了明顯的抑制(P＜0.05),培養(yǎng)結(jié)束時③、④、⑤、⑥組間細胞密度無顯著性差異(P=0.876)。

圖7 小球藻培養(yǎng)濾液對抑食金球藻的生長及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Fig.7 Effect of C. vulgaris culture medium filtrate on growth and fluorescence parameters of A. anophageferens

2.4.2 小球藻培養(yǎng)濾液對抑食金球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響 小球藻培養(yǎng)濾液對抑食金球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響見圖7(B—F)。單因子方差分析結(jié)果顯示: 第 1天, 各組各葉綠素?zé)晒鈪?shù)與對照組(①)相比差異均無顯著性差異; 第2天時, 小球藻培養(yǎng)濾液對抑食金球藻的影響凸顯出來, ②組的各葉綠素?zé)晒鈪?shù)與對照無顯著差異, 但④、⑤、⑥組的Fv/Fm、ΦPSⅡ、alpha值下降劇烈, 幾乎檢測不到熒光信號,與對照差異顯著(P＜0.05), ③組的 Fv/Fm、ΦPSⅡ、alpha值也顯著低于對照組(P＜0.05); 第3—7天, ②組的各葉綠素?zé)晒鈪?shù)與對照無顯著差異, ③組的各熒光參數(shù)的值逐漸恢復(fù), 培養(yǎng)結(jié)束時已與對照無顯著性差異, 但④、⑤、⑥組的各參數(shù)變化劇烈, 其中Fv/Fm、ΦPSⅡ、alpha值首次出現(xiàn)了不同程度的明顯上升, 但持續(xù)2 d之后又跌落下來, Ik值在高于對照組的范圍內(nèi)大幅波動、rETRmax值亦上下波動。

3 討論

3.1 單培養(yǎng)條件下抑食金球藻的生長狀態(tài)

結(jié)合圖3及表1發(fā)現(xiàn), 不同起始密度對種群的生長有明顯的影響, 隨著起始密度的增加, 抑食金球藻的K值有逐漸降低的趨勢, 董云偉等在研究赤潮常見原因種塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)單培養(yǎng)的生長狀態(tài)時亦得到了相似的規(guī)律(董云偉等,2004)。另外, 值得注意的是不同的起始密度下抑食金球藻種群在接種后 5d內(nèi)的生長都是非常緩慢的, 種群數(shù)量基本處于穩(wěn)定狀態(tài), 而當(dāng)種群密度一旦超過一定閾值, 會立即進入指數(shù)增長期, 并持續(xù)較長時間的快速增長, 如接種密度為1×104cell/mL時, 種群從第 6天的 2.8×104cell /mL迅速增加至第 14天的1770×104cell /mL; 接種密度為 2×104cell/mL 時, 種群從第4天的2.77×104cell/mL迅速增加至第14天的1370×104cell/mL; 接種密度為 4×104cell/mL 時, 種群從第7天的 4.2×104cell/mL迅速增加至第15天的1475×104cell/mL。指數(shù)增長的時間都持續(xù)了9d左右,進入穩(wěn)定期時都達到了較高的細胞密度(5000×104cell/mL左右)。

上述現(xiàn)象清晰地表明抑食金球藻具有藻細胞活性持續(xù)時間長、生長速度快、穩(wěn)定期細胞密度高的特點, 這可能是抑食金球藻褐潮暴發(fā)后很難控制的原因之一(Gobler et al, 2004)。

3.2 共同培養(yǎng)條件下小球藻對抑食金球藻生長的影響

由圖4、圖5、圖6可知兩種藻以不同的比例共同培養(yǎng), 小球藻都對抑食金球藻的生長產(chǎn)生了抑制作用, 與對照相比抑食金球藻的最大環(huán)境容量都明顯下降。隨著抑食金球藻細胞接種密度比由小到大,相比于對照組的 K值越來越小(占比分別為 4.58%、3.44%及 2.51%), 抑食金球藻生長受到的抑制作用亦越來越強。

3.3 小球藻培養(yǎng)濾液對抑食金球藻生長及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

實驗結(jié)果顯示: 加入5 mL的小球藻濾液不會對抑食金球藻的生長產(chǎn)生影響, 但當(dāng)加入的量≥10 mL就會對抑食金球藻的生長產(chǎn)生顯著的抑制作用, 加入的量≥20 mL時抑食金球藻細胞數(shù)量不會再增加而是逐漸減少至5×104cell/mL以下。潘克厚等(2007)將微藻種間競爭的機理主要分為資源競爭、化感作用和細胞接觸。結(jié)合共培養(yǎng)實驗和小球藻濾液培養(yǎng)實驗結(jié)果, 小球藻對抑食金球藻抑制作用應(yīng)是通過化感作用實現(xiàn)的, 即小球藻分泌的胞外產(chǎn)物中含有對抑食金球藻的生長具有強烈抑制作用的化感物質(zhì)。

為深入探討小球藻對抑食金球藻的化感抑藻機理, 作者開展了小球藻培養(yǎng)液對抑食金球藻生長及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響研究。Fv/Fm是PSⅡ的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量, 反映 PSⅡ的最大光能轉(zhuǎn)換效率, 非脅迫條件下該參數(shù)的變化極小, 脅迫條件下該參數(shù)明顯下降。本實驗結(jié)果顯示加入5 mL以上的小球藻培養(yǎng)濾液的組別, 接種后第 2天抑食金球藻的 Fv/Fm的值都出現(xiàn)了明顯下降, 這說明抑食金球藻的 PSⅡ已受到損害。其中加入10 mL的處理組, 經(jīng)過一定時間后可恢復(fù)至與對照無顯著差異的水平, 說明 PSⅡ受到的這種程度損傷可以恢復(fù)。但加入20、35、50 mL的處理組, 經(jīng)過一段時間也沒有恢復(fù)到正常水平, 并且細胞密度沒有出現(xiàn)增長的趨勢而是逐漸降低。因此,作者認為當(dāng)加入的小球藻濾液超過一定量時, 即可對抑食金球藻 PSⅡ造成不可恢復(fù)的損傷, 進而造成抑制抑食金球藻的生長, 直至死亡。

加入5 mL以上的小球藻培養(yǎng)濾液的組別, 接種后第2天抑食金球藻ΦPSⅡ、Alpha的值都出現(xiàn)了明顯下降。ΦPSⅡ是PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)量子產(chǎn)量, 它反映了 PSⅡ反應(yīng)中心在有部分關(guān)閉情況下實際原初光能捕獲效率。ΦPSⅡ的降低說明小球藻濾液阻止抑食金球藻細胞同化力(NADPH, ATP)的形成, 從而影響對碳的固定與同化, 進而影響細胞的生長。Alpha是快速光曲線的初始斜率, 反映了植物對光能的捕獲能力, Alpha的降低說明藻細胞對光能的利用效率下降。Ik是最小飽和光強, 與植物對強光的耐受能力有關(guān),Ik的上升說明小球藻濾液的加入可以在一定程度上增強抑食金球藻細胞對強光的耐受能力, 但 Ik值大幅波動也說明了藻細胞光系統(tǒng)處于不正常狀態(tài), 不利于光合作用的正常進行, 進而影響抑食金球藻的生長。

3.4 小球藻在褐潮應(yīng)急處置中的應(yīng)用前景

張雅琪等(2013)進行了改性黏土對褐潮種的去除研究, 實驗發(fā)現(xiàn)改性黏土對抑食金球藻的去除效率普遍很低。Randhawa等(2012)發(fā)現(xiàn)一定量的 H2O2可有效去除高密度的抑食金球藻, 但是費用比較昂貴。因此, 目前國內(nèi)外還沒有能夠有效應(yīng)急處置褐潮的方法。本實驗結(jié)果表明在共同培養(yǎng)體系中的小球藻及單培養(yǎng)的小球藻濾液對抑食金球藻均有著強烈的抑制作用, 表明小球藻在近岸貝類養(yǎng)殖區(qū)褐潮危害的應(yīng)急處置中具有極大的應(yīng)用潛力。若將新鮮的小球藻濃縮液緩釋于貝類養(yǎng)殖的微環(huán)境中, 則既可抑制抑食金球藻的生長又可為養(yǎng)殖微環(huán)境中貝類提供餌料的微藻, 這將對降低褐潮對養(yǎng)殖貝類的危害及提高養(yǎng)殖經(jīng)濟效益具有非常重要的實際應(yīng)用價值。但上述研究均是在實驗生態(tài)學(xué)條件下完成的, 具有穩(wěn)定的光照, 營養(yǎng)鹽和適宜的溫度, 且排除共棲異養(yǎng)細菌等諸多環(huán)境因子對微藻間相互作用的影響(Nakashima et al, 2006; Yu et al, 2006)。因此, 若要將小球藻或小球藻化感物質(zhì)規(guī)?；瘧?yīng)用于貝類養(yǎng)殖海域褐潮危害的應(yīng)急處置之前還需做進一步實踐摸索。

4 結(jié)論

(1) 單培養(yǎng)體系中, 抑食金球藻具有藻細胞活性持續(xù)時間長、生長速度快、穩(wěn)定期細胞密度高(5×107cell/mL)的特點, 這可能是抑食金球藻褐潮暴發(fā)后很難控制的原因之一。

(2) 共培養(yǎng)實驗中, 小球藻對抑食金球藻生長具有強烈的抑制作用, 且抑制作用隨著小球藻所占比例的升高而增強; 濾液實驗中發(fā)現(xiàn), ≥10mL小球藻培養(yǎng)濾液的加入可對抑食金球藻的生長和葉綠素?zé)晒鈪?shù)產(chǎn)生顯著的影響(P＜0.05), 生長速度減緩或滯長, 葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、ΦPSⅡ、alpha的值降低,Ik的值增加, PSⅡ受到損害, 隨著濾液加入量的增加,損害程度加深, 并且不可恢復(fù)。

王金鳳, 2007. 三種海洋經(jīng)濟微藻與赤潮異灣藻的競爭研究.青島: 中國海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文, 24—25

畢相東, 王宏坡, 郭永軍等, 2016. 一種餌料微藻濃縮液緩釋儀: 中國, 201520754681. 2016-01-13

劉愛英, 宋秀凱, 秦華偉等, 2013. 2011年煙臺四十里灣微微型金藻褐潮分析. 海洋湖沼通報, (3): 73—79

楊小茹, 蘇建強, 鄭天凌, 2008. 化感作用在赤潮調(diào)控中的意義及前景. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 28(2): 219—226

宋林生, 邱麗梅, 劉 瑞等, 2013. 一種抑食金球藻的快速檢測方法: 中國, 201310409553. 2013-12-25

張雅琪, 俞志明, 宋秀賢等, 2013. 改性黏土對褐潮生物種Aureococcus anophagefferens的去除研究. 海洋學(xué)報,35(3): 197—203

國家海洋局. 2010—2014. 2009—2013中國海洋災(zāi)害公報. 北京: 國家海洋局

董云偉, 董雙林, 劉相義, 2004. 不同起始濃度對塔瑪亞歷山大藻和赤潮異彎藻種群競爭的影響. 中國海洋大學(xué)學(xué)報,34(6): 964—968

廖 洋, 楊錫暢, 2012. 褐潮來襲: 危害大 待破解. 中國科學(xué)報, 2012-07-25(A1) 要聞

潘克厚, 王金鳳, 朱葆華, 2007. 海洋微藻間競爭研究進展.海洋科學(xué), 31(5): 58—62

Bricelj V M, Lonsdale D J, 1997. Aureococcus anophagefferens:Causes and ecological consequences of brown tides in U.S. mid-Atlantic coastal waters. Limnol Oceanogr, 42(5): 1023—1038

Bricelj V, MacQuarrie S, Schaffner R, 2001. Differential effects of Aureococcus anophagefferens isolates (“brown tide”) in unialgal and mixed suspensions on bivalve feeding. Mar Biol, 139(4): 605—616

Cosper E M, Dennison W C, Carpenter E J et al, 1987. Recurrent and persistent brown tide blooms perturb coastal marine ecosystem. Estuaries, 10(4): 284—290

Gobler C J, Boneillo G E, Debenham C J et al, 2004. Nutrient limitation, organic matter cycling, and plankton dynamics during an Aureococcus anophagefferens bloom. Aquati Microb Ecol, 35(1): 31—43

Kong F Z, Yu R C, Zhang Q C et al, 2012. Pigment characterization for the 2011 bloom in Qinhuangdao implicated “brown tide” events in China. Chin J Oceanol Limnol, 30(3): 361—370

Nakashima T, Miyazaki Y, Matsuyama Y et al, 2006. Producing mechanism of an algicidal compound against red tide phytoplankton in a marine bacterium γ-proteobacterium.Appl Microbiol Biotechnol, 73(3): 684—690

Probyn T, Pitcher G, Pienaar R, 2001. Brown tides and mariculture in Saldanha Bay, South Africa. Mar Pollut Bull,42(5): 405—408

Ralph P J, Gademann R, 2005. Rapid light curves: a powerful tool to assess photosynthetic activity. Aquati Bot, 82(3):222—237

Randhawa V, Thakkar M, Wei L P, 2012. Applicability of hydrogen peroxide in brown tide control-culture and microcosm studies. PLoS One, 7(10): e47844

Sieburth J M, Johnson P W, Hargraves P E, 1988. Ultrastructure and ecology of Aureococcus anophageferens gen. et sp. nov.(Chrysophyceae): The dominant picoplankter during a bloom in Narragansett Bay, Rhode Island, summer 1985.Journal of Phycol, 24(3): 416—425

Yu J, Tang X X, Tian J Y et al, 2006. Effects of elevated CO2on sensitivity of six species of algae and interspecific competition of three species of algae. J Environ Sci, 18(2):353—358

Zhang Q C, Qiu L M, Yu R C et al, 2012. Emergence of brown tides caused by Aureococcus anophagefferens Hargraves et Sieburth in China. Harmful Algae, 19: 117—124