胡星星 王叢叢, 產(chǎn)久林 許強華,,

(1. 上海海洋大學海洋科學學院 上海 201306; 2. 大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)省部共建教育部重點實驗室 上海 201306;3. 國家遠洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心 上海 201306; 4. 遠洋漁業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 上海 201306)

微 RNA(microRNA, miRNA)是在真核生物中存在的一類長度為22—24個核苷酸的非編碼RNA, 主要通過與靶基因的非翻譯區(qū)(3′ Untranslated Regions,3′UTR)結(jié)合, 在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(Ambros,2001)。自1993年第一個非編碼小RNA——(lin-4)被證實(Lee et al, 1993), 越來越多的microRNA被發(fā)現(xiàn)并得到研究。目前為止, 在人類基因組中已經(jīng)鑒定出超過1000種microRNA, 并且這些microRNA調(diào)控了約 50%基因組的活性(Hartmann et al, 2011)。microRNA在脊椎動物中高度保守, 調(diào)控一系列重要的生物過程, 同時也參與一些疾病的發(fā)生, 如癌癥、病毒性疾病、傳染性疾病等(Shen et al, 2010)。迄今為止, 也有不少關(guān)于microRNA對紅細胞發(fā)生調(diào)控的研究報道。Felli等(2005)發(fā)現(xiàn), miR-221與 miR-222過表達損害紅系祖細胞的正常增殖與分化, 它們主要通過抑制Kit受體蛋白的表達影響正常紅細胞的發(fā)生。研究表明, 在CD34+祖細胞中強制性表達miR-223,對紅系分化重要蛋白 LMO2的表達有明顯的抑制作用, 從而擾亂紅系的分化進程(Felli et al, 2009)。

生物的造血分化是一個動態(tài)且復雜的過程, 發(fā)生在生物的整個生活史中。造血過程主要由造血干細胞分化產(chǎn)生各種血細胞, 包括紅細胞、白細胞、淋巴細胞等(Ge et al, 2014)。其中, 紅細胞生成是脊椎動物造血過程中最重要的部分之一。紅細胞的正常發(fā)育涉及很多轉(zhuǎn)錄因子的參與和調(diào)控(Tsiftsoglou et al,2009), 包括鋅指蛋白 GATA家族成員(Dore et al,2008), 血紅素生物合成的限速酶(5′-aminolevulinate synthase 2, ALAS2)等的參與(Harigae et al, 1998)。亞鐵血紅素作為血紅蛋白的色素部分, 由鐵原子及原卟啉區(qū)組成。亞鐵血紅素的正常生物合成需要8種酶的輔助, 為了防止此生物合成過程中有毒中間產(chǎn)物的積累, 需要第一限速酶 ALAS(5-氨基乙酰丙酸合酶)的調(diào)節(jié)。ALAS包含兩種同工酶ALAS1和ALAS2, ALAS1在生物體內(nèi)很多組織都有表達, ALAS2只在紅系祖細胞中表達, 為特異調(diào)節(jié)紅系發(fā)育的限速酶。ALAS2突變會造成原卟啉合成減少, 從而導致亞鐵血紅素合成不足引發(fā)血紅細胞性貧血癥(Fujiwara et al, 2015)。

血紅細胞的產(chǎn)生幾乎成為脊椎動物的獨有特征。然而, 有一類生活在極端寒冷的南極海域的脊椎動物——南極冰魚, 隸屬于南極魚亞目(Notothenioidei), 在長期的適應性進化中逐漸丟失血紅細胞, 是目前已知的唯一缺乏具有功能性血紅細胞的脊椎動物, 它們主要依靠皮膚和鰓吸收溶解在水中的氧氣(許強華等, 2014)。

在本項目的前期研究中, 以南極獨角雪冰魚(Chionodraco hamatus)為研究對象, 通過對血液發(fā)生主要組織頭腎的microRNA組分分析發(fā)現(xiàn), 冰魚頭腎中存在大量高表達的 microRNAs, 這些高表達的microRNAs可能抑制著冰魚紅血球的發(fā)生(Xu et al,2015)。在此基礎上, 本研究針對獨角雪冰魚頭腎中異常高表達的 miR-7132, 利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚和細胞轉(zhuǎn)染實驗, 首次研究了該microRNA在紅細胞生成過程中的功能及作用機制。本研究為揭示miR-7132在南極冰魚體內(nèi)造血的影響機制提供了理論依據(jù), 并為進一步探討極端低溫環(huán)境條件下microRNA的造血作用機制與進化研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集 獨角雪冰魚樣本由第31次南極考察隊乘“雪龍”號作業(yè)采集于南極埃默里冰架。活體迅速凍存于-80°C超低溫冰箱。凍存樣本用錫箔紙包裹后放液氮中帶回上海海洋大學海洋科學學院保護遺傳學實驗室, -80°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 實驗動物與細胞 293T細胞系(人腎上皮細胞)作為細胞轉(zhuǎn)染實驗的常用細胞系, 其轉(zhuǎn)染效率高, 可便捷地獲得轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)外蛋白(Meissner et al, 2001)。本實驗中293T細胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基中,完全培養(yǎng)基由 DMEM(改良 Eagle培養(yǎng)基)、10%FBS(胎牛血清)和雙抗(100U 青霉素, 100μg鏈霉素)組成, 培養(yǎng)條件為5%CO2, 培養(yǎng)溫度為37°C。顯微注射所用一細胞期斑馬魚胚胎來自本實驗室飼養(yǎng)野生型斑馬魚, 由達到性成熟的健康野生型斑馬魚繁殖所得。

1.1.3 主要試劑 Trizol試劑(Life Technologies)、酚氯仿異戊醇(25:24:1)、異丙醇、1×TAE緩沖液、瓊脂糖、乙醇、過氧化氫 30%溶液、Trypsin-EDTA Solution(上海生工生物工程公司); primer 2X MIX(北京全式金生物技術(shù)公司)、DNA膠回收試劑盒(Axygen Biosciences, USA)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PMD18-T載體(TaKaRa, Japan)、DNA Marker、DH5α 感受態(tài)細胞(TaKaRa, Japan); O-Dianisidine (SIGMA, USA)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA合成 取獨角雪冰魚的肌肉組織, 依照Trizol法(Life Technologies)步驟提取總RNA, 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量與完整性, 分光光度法(Thermo)測定總 RNA 的濃度; 采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)合成cDNA, 保存于-20°C備用。

1.2.2 獨角雪冰魚頭腎小RNA組分分析 提取獨角雪冰魚頭腎總RNA, 經(jīng)Hi-seq2000 Small RNA測序儀對 RNA組分進行分析, 對測序后的初始數(shù)據(jù)進行去重處理, 并與miRNA數(shù)據(jù)庫中已知miRNA進行序列比對, 鑒定miRNA類別。

1.2.3 引物設計與合成 根據(jù)本實驗室對獨角雪冰魚轉(zhuǎn)錄組測序所得的 ALAS2的序列, 通過比對本實驗室自行完成的獨角雪冰魚的全基因組序列(未發(fā)表), 獲得ALAS2的3′UTR序列。根據(jù)獲得的ALAS2的3′UTR序列, 由Primer5.0軟件設計得到特異性引物序列, 同時選取適合的酶切位點, 擬擴增 ALAS2的 3′UTR 序列(表 1)。

1.2.4 ALAS2的3′UTR片段克隆 PCR反應擴增得到ALAS2 3′UTR片段, 反應體系25μL: primer 2X MIX(北京全式金生物技術(shù)公司)13μL, 上下游引物各1μL, cDNA模板1.5μL, 加水至25μL。反應條件: 95°C預變性5min, 94°C變性45s, 58°C退火45s, 72°C延伸90s, 4°C保存。膠回收反應試劑盒(上海生工生物工程公司)回收PCR反應產(chǎn)物, 回收產(chǎn)物連接至pMD18-T載體上, 轉(zhuǎn)化并篩選陽性克隆(北京天根生化科技公司), 菌液PCR產(chǎn)物送上海生工測序。

表1 引物序列與限制性內(nèi)切酶Tab.1 Primer sequence and restriction enzyme

1.2.5 固藍染色 對受精后一細胞期的斑馬魚胚胎進行顯微注射, miR-7132(蘇州吉瑪基因公司)的注射濃度為 50μm。36h后通過固藍染色固定胚胎體內(nèi)血紅蛋白, 固藍染液主要成分為: O-dianisdine(1.5g/L)、醋酸鈉(0.1mol/L, pH4.5)、30%過氧化氫溶液、無水乙醇。經(jīng)4%多聚甲醛固定胚胎6h以上, 加入磷酸鹽緩沖液(1×PBS)洗去胚胎表面殘余的多聚甲醛與雜質(zhì), 加入適量的固藍染液于搖床上避光染色20min, 棄去染液加入甘油, 于顯微鏡下成像。應用圖像處理軟件Image J對圖片中所固定的血紅蛋白的區(qū)域進行統(tǒng)計。

1.2.6 細胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前一天將狀態(tài)良好的 293T細胞接種于6孔培養(yǎng)板中, 于完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。次日, 觀察到細胞密度約70%時可進行轉(zhuǎn)染, 按照轉(zhuǎn)染試劑 Attractene Transfection(QIAGEN)說明書步驟,用不含血清的培養(yǎng)基進行 miR-7132與 pmir-ALAS2 3′UTR質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染, 同時以共同轉(zhuǎn)染 NC(negative control, 5′ UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 3′)與pmir-ALAS2 3′UTR質(zhì)粒作為陰性對照組, 以只轉(zhuǎn)染pmir-ALAS2 3′UTR質(zhì)粒作為空白對照組, 轉(zhuǎn)染后6h更換為完全培養(yǎng)基, 繼續(xù)培養(yǎng)至 24h。收集此時的細胞, 采用 Dual-Luciferase?報告基因檢測試劑盒(Promega, USA)檢測熒光素酶活性, 依據(jù)實驗數(shù)據(jù),計算螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶(Firefly Luc/Renilla Luc)活性的比值。

1.2.7 斑馬魚顯微注射 將上述構(gòu)建的 Tol2-EGFP-ALAS2 3′UTR(100ng/μL)與 miR-7132(50μm)共同注射入處于第一細胞期的斑馬魚胚胎。24h后熒光顯微鏡下觀察并提取胚胎總蛋白, 進行蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 獨角雪冰魚ALAS2 3′UTR表達質(zhì)粒構(gòu)建

將擴增得到的ALAS2 3′UTR連接至PMD18-T載體上, 分別進行雙酶切。如圖1所示, 得到酶切產(chǎn)物片段長度為 1313bp, 將酶切產(chǎn)物連接至 pmir-GLO (SacⅠ, SalⅠ)與 Tol2-EGFP (MfeⅠ, NotⅠ)表達質(zhì)粒中。

2.2 miR-7132對血紅蛋白表達的影響

顯微注射miR-7132的斑馬魚胚胎, ALAS2蛋白的表達水平明顯下降(圖2a)。這表明: ALAS2可能是miR-7132的靶基因。應用圖像分析軟件Image J對固藍染色后的結(jié)果進行分析, 統(tǒng)計斑馬魚胚胎血紅蛋白區(qū)域的大小, 進行顯著性分析。固藍染色結(jié)果顯示(圖 2b), 顯微注射 miR-7132的斑馬魚胚胎體內(nèi)血紅蛋白的含量顯著低于注射 Negative Control(NC)對照組與空白(WT)對照組, 說明miR-7132在一定程度上對血紅蛋白的表達起到抑制作用。

圖1 表達質(zhì)粒構(gòu)建電泳圖Fig.1 Electrophoresis of expression plasmids construction

圖2 過表達miR-7132降低斑馬魚胚胎ALAS2和血紅蛋白的表達水平Fig.2 Overexpression of the miR-7132 reduced the level of hemoglobin and ALAS2 in zebrafish embryo

2.3 miR-7132過表達對紅系分化基因 ALAS2表達的影響

前期的研究中, 通過對獨角雪冰魚造血組織頭腎中小RNA的組分進行分析, 發(fā)現(xiàn)miR-7132在獨角雪冰魚頭腎組織中顯著高表達(Xu et al, 2015)。因此,對miR-7132可能作用的靶基因進行生物學信息預測,預測結(jié)果表明(圖3a), ALAS2基因可能是miR-7132的靶基因, 通過3′UTR區(qū)域與miR-7132進行互補配對。

為確定 miR-7132對紅系分化相關(guān)基因 ALAS2的作用, 將ALAS2的3′UTR靶位點附近1313bp片段連接至 pmirGLO雙熒光素酶報告質(zhì)粒中, 構(gòu)建得到pmi-CH ALAS2 3′UTR質(zhì)粒。將 miR-7132與 pmi-CH ALAS2 3′UTR質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細胞, 24h收集細胞檢測熒光素酶與海腎熒光素酶活性。結(jié)果顯示, 共轉(zhuǎn)染miR-7132與pmi-CH ALAS2 3′ UTR質(zhì)粒組的螢火蟲熒光素酶的相對活性顯著低于共轉(zhuǎn)染 NC與pmi-CH ALAS2 3′ UTR 質(zhì) 粒組(圖 3b), 表 明miR-7132在體外水平對ALAS2的表達具有顯著抑制作用。

2.4 體內(nèi)過表達miR-7132對獨角雪冰魚ALAS2基因表達的影響

為進一步驗證miR-7132對ALAS2基因的作用,構(gòu)建了可在體內(nèi)表達 GFP綠色熒光蛋白基因的表達質(zhì)粒, 將ALAS2 3′UTR連接至GFP熒光蛋白下游組成Tol2-GFP-CH ALAS2 3′ UTR表達質(zhì)粒。

以 miR-7132終濃度為 50μm、質(zhì)粒終濃度為100ng/μL的注射量以一定比例混合后顯微注射斑馬魚第一細胞期胚胎, 24h后觀察胚胎熒光強度變化情況。同時, 提取斑馬魚胚胎總蛋白進行 Western blot檢測GFP熒光蛋白的表達。結(jié)果顯示, 注射miR-7132后, 斑馬魚胚胎體內(nèi)所表達的 GFP熒光強度顯著低于注射 NC的陰性對照組與空白對照組(圖 4a, b)。Western blot結(jié)果顯示, 注射 miR-7132的實驗組的GFP蛋白表達顯著低于注射NC的陰性對照組與空白對照組(圖 4c), 表明 miR-7132可在體內(nèi)顯著抑制ALAS2基因的表達。

圖3 293T細胞轉(zhuǎn)染鑒定miR-7132對ALAS2的抑制作用Fig.3 Identify the inhibition of miR-7132 on ALAS2 by the 293T cells transfection

3 討論

圖4 體內(nèi)注射miR-7132檢測GFP的表達Fig.4 Detect the expression of GFP protein by injecting miR-7132 in vivo

紅細胞的生成對于脊椎動物的造血活動是非常重要的, 紅細胞數(shù)量的異常增多或減少都會導致疾病的發(fā)生, 例如異常紅血球生成性貧血, 骨髓增生異常綜合征等(Ge et al, 2014)。因此, 對紅細胞生成機制的深入研究有利于血液疾病的檢測與治療(Kim et al,2007)。血紅蛋白是紅細胞的重要組成部分, 是由亞鐵血紅素與球蛋白組成, 在生物體內(nèi)負責攜帶氧氣至全身各處以維持生命活動的正常進行(Fujiwara et al,2006)。生物體內(nèi)約 85%的亞鐵血紅素由紅細胞負責合成, 亞鐵血紅素在紅細胞中合成的第一步則需要ALAS2酶的催化, ALAS2是血紅素生物合成過程中最重要的限速酶之一(Barman-Aks?zen et al, 2015)。已有研究表明, ALAS2作為重要的造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子參與血細胞的生成, 例如 ALAS2缺失的鼠胚胎干細胞分化產(chǎn)生的紅細胞亞鐵血紅素含量嚴重不足。作為紅細胞的組成成分, 亞鐵血紅素缺乏時, 會導致異常的紅細胞發(fā)生并且引發(fā)血液疾病(Harigae et al, 2003)。

隨著對microRNA研究的不斷深入, 研究者發(fā)現(xiàn)microRNA調(diào)控生物體內(nèi)多種生物過程。microRNA參與紅細胞發(fā)生的研究也逐漸得到關(guān)注。調(diào)控紅細胞生成的網(wǎng)絡是錯綜復雜的, 同一個轉(zhuǎn)錄因子可能由多個miRNA對其發(fā)揮作用, 同時, 某一個miRNA也可能作用于多個轉(zhuǎn)錄因子, 且多個轉(zhuǎn)錄因子之間往往存在著相互作用(Kaufman et al, 2001)。孫紅英等(2013)研究證明了 miR-218調(diào)控 ALAS2在紅細胞分化中的作用及機制。miR-218可以作用于 ALAS2的3′UTR區(qū)域, 過表達miR-218使ALAS2的表達顯著下調(diào), ALAS2是參與鐵代謝與紅細胞分化的關(guān)鍵基因(Ajioka et al, 2006), 體內(nèi)缺乏ALAS2將引發(fā)鐵粒幼細胞性貧血等血液疾病(Astner et al, 2005)。同時,ALAS2表達的減少還會導致其下游基因珠蛋白表達的降低(孫紅英, 2013)。Xu等(2015)研究中, 通過對多個在南極冰魚頭腎組織中高表達的miRNA進行靶基因預測, 發(fā)現(xiàn)有91個miRNA作用于已知的5個紅細胞生成標志基因, 其中, ALAS2作為靶基因被最多數(shù)量的miRNA所作用。本研究中miR-7132對ALAS2的靶向調(diào)控作用與Xu等研究相吻合。

近年來, 有研究表明 miR-7132可能與鯉魚免疫系統(tǒng)的發(fā)育及免疫應答相關(guān)(Thai et al, 2007)。作者通過Solexa測序技術(shù)(Solexa公司第二代測序技術(shù))并結(jié)合生物信息學分析成功從鯉魚的脾臟組織中鑒定出192種保守性較高的miRNA, 其中miR-7132在鯉魚脾臟中特異性表達, 由此作者推測 miR-7132可能作用于一個或多個轉(zhuǎn)錄因子而參與免疫過程(陳功義等,2015)。但是, 關(guān)于miR-7132參與血紅細胞發(fā)生的研究鮮有報道。

斑馬魚胚胎透明, 可隨時進行活體觀察, 受精后24小時心血管系統(tǒng)已基本形成, 便于研究心血管系統(tǒng)的發(fā)育和功能。此外, 通過顯微注射技術(shù)可將外源基因或含標記基因的質(zhì)粒高效率整合至斑馬魚基因組中, 同時結(jié)合熒光顯微鏡觀察、胚胎染色等實驗方法對基因功能進行分析(Fu et al, 2009; Grabher et al,2011)。在 Su等研究中, 生物信息學分析結(jié)果顯示meis1為miR-144的靶基因, 作者運用斑馬魚胚胎顯微注射技術(shù), 向斑馬魚胚胎共注射 miR-144與GFP-meis1 3′UTR的復合體并通過Western blot檢測GFP蛋白表達, 成功驗證了miR-144對斑馬魚造血過程的影響機制(Su et al, 2014)。在本研究中, 由于沒有南極冰魚的胚胎, 再加上microRNA在不同物種中均比較保守, 所以借助斑馬魚顯微注射來研究miR-7132的功能, 這也是目前非模式魚類物種功能基因驗證的主要手段之一。事實上, 在注射miR-7132后, 我們確實發(fā)現(xiàn)miR-7132可以降低ALAS2蛋白的表達(圖2a)。這進一步提示, 利用斑馬魚顯微鏡注射來研究miR-7132的功能是可行的。

4 結(jié)論

本研究中, 通過 Hi-Seq轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在南極冰魚頭腎組織中首次分離并鑒定得到南極冰魚miR-7132的序列, 通過生物信息學軟件(miRBase數(shù)據(jù)庫, TargetScan靶基因預測, PicTar靶基因預測等)預測 miR-7132潛在的靶基因。同時, 以斑馬魚作為模型進行體內(nèi)實驗驗證, 并結(jié)合細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)(細胞內(nèi)過表達miRNA及靶蛋白)、熒光素酶報告系統(tǒng)、胚胎顯微注射技術(shù)等實驗手段綜合驗證了miR-7132通過調(diào)節(jié) ALAS2的表達參與南極冰魚紅細胞生成過程。在本研究之前, 并未有 miR-7132對紅細胞生成作用的研究報道。本實驗將在后續(xù)研究中, 擬對miR-7132進行體內(nèi)敲除, 更好地研究miR-7132對紅細胞發(fā)生的作用機制。

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