張躍環(huán) 秦艷平 張 揚 李 軍 肖 述 向志明馬海濤 喻子牛①

(1. 中國科學院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室 廣東省應用海洋生物學重點實驗室 廣州 510301;2. 南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心 廣州 510275)

對于貝類選擇育種而言, 連續(xù)幾代的選擇均可以獲得積極的選擇反應(張國范等, 2009)。Haskin等(1979)對美洲牡蠣(Crassostrea virginica)進行了連續(xù)四代的抗單孢子蟲病選擇, 使其抗病力比野生群體提高了 8—9倍; Newkirk(1982)認為歐洲牡蠣(Ostrea edulis)生長選擇每代提高 10%—20%是合理的;Paynter等(1990)報道了養(yǎng)殖人員經(jīng)過18代選擇的美洲牡蠣, 其生長速度顯著快于野生群體; Nell等(1999)對悉尼巖牡蠣(Saccostrea commercialis)體重進行了連續(xù) 2代選擇, 獲得了 17.8%的遺傳改進量; Nell等(2006)進行悉尼巖牡蠣三代的抗單孢子蟲病(QX疾病,Queensland Unknown Disease)選育, 獲得了較強的抗病系; Li等(2011)和Wang等(2012)對長牡蠣(C. gigas)進行了連續(xù)6代的混合選擇, 獲得了積極的改良效果,培育出“海大1號”長牡蠣新品種; Dégremont等(2015)對長牡蠣進行了連續(xù)4代的抗皰疹病毒選育, 獲得了抗性較強的牡蠣新品系, 存活力提高了61.8%。

至于其它常見經(jīng)濟貝類, Zheng等(2004, 2006)對海灣扇貝(Argopecten irradians)進行了連續(xù)4代的混合選擇, 發(fā)現(xiàn)基礎群體對其遺傳效果具有顯著影響,培育出“中科紅”海灣扇貝; Zheng等(2013)還對華貴櫛孔扇貝(Chlamys nobilis)進行了橘紅色閉殼肌品系連續(xù)4代的選育, 培育出“南澳1號”華貴櫛孔扇貝新品種; 閆喜武等(2010)和劉振等(2014)對菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)進行了連續(xù) 8代混合選擇,培育出“斑馬蛤”菲律賓蛤仔新品種; You等(2009)對九孔鮑(Haliotis diversicolor)進行了連續(xù) 4代混合選擇, 培育出“東優(yōu)1號”雜色鮑新品種。

先前, 我們對熊本牡蠣(C. sikamea)的多嵴、無嵴品系進行了一次上選, 經(jīng)過一周年的養(yǎng)成, 獲得了比較好的選擇反應, 并且獲得了8.41%、7.71%遺傳改進量(張躍環(huán)等, 2016)。本研究是以兩個品系子一代選擇組為材料, 繼續(xù)觀測兩個品系的選擇反應、現(xiàn)實遺傳力, 計算二次選擇的遺傳改進量, 為熊本牡蠣遺傳育種提供理論基礎和實踐經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1 親本來源

如圖1所示, 本研究以2012年5月采集的湛江野生群體熊本牡蠣為材料, 構(gòu)建了核心基礎群。于2013年5月, 從核心基礎群中篩選出多嵴和無嵴品系,按照 10%留種率, 進行了兩個品系熊本牡蠣子一代選擇反應及其現(xiàn)實遺傳力研究。在此基礎上, 于2014年 5月, 以多嵴、無嵴品系熊本牡蠣上選的子一代作為材料, 隨機篩選每個品系若干個個體(剔除掉外部形態(tài)不整齊個體)作為育種材料進行子二代連續(xù)上選。

1.2 實驗處理

利用截頭法分別對多嵴和無嵴品系子一代進行混合選擇, 留種率均為10%, 選擇強度(i)均為1.755。從兩種類型中各隨機抽取 1200個個體, 用游標卡尺進行測量(精確至 0.02mm), 繪制個體殼高大小的頻率分布圖(圖 1)。從每個群體中選擇 10%的最大個體(120個), 作為選擇組2(selected group 2, SG2), 在剩余的個體中隨機抽取120個個體作為對照組2(control group2, CG2)。其中, 多嵴品系親本的截點為62.37mm, 雌雄比例為 87:33; 無嵴品系親本的截點為57.46mm, 雌雄比例為81:39(圖1)。

圖1 兩個品系熊本牡蠣子二代選擇育種技術路線圖Fig.1 Pedigree of selected strains indicating founder strain and selection intensity(i) for a successive two-generation selection

1.3 子代培育

采用解剖方式獲取配子, 為了保證所有雄性個體的繁殖機會, 每個實驗組均采用單個雄性個體與所有卵子配對的原則進行(1♂:n♀)。實驗中為了防止發(fā)生組間污染, 利用300目篩絹網(wǎng)進行幼蟲選育, 各實驗組均保留D型幼蟲約1.2億個, 多余幼蟲全部放掉; 每個實驗組放置在3個10m3水泥池中培養(yǎng), 幼蟲培養(yǎng)密度控制在4ind./mL。

幼蟲培育期間, 鹽度控制在 20—25; 稚貝培養(yǎng)的鹽度控制在15—20。室內(nèi)培育期間, 6日齡以前, 投喂云微藻(Chlorella sp.), 之后混合投喂云微藻和牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)(體積比=1:1), 投餌量視攝食情況而定, 日投喂量在(5—10)×104cell/mL。當幼蟲出現(xiàn)鰓原基、眼點、足時, 利用波紋板采苗。當稚貝殼高在10mm左右時裝入5mm網(wǎng)孔塑料袋在竹林鹽廠生態(tài)池中進行中間育成, 每袋密度控制在240—300個。隨著稚貝生長, 定期調(diào)整密度, 最后移至孔徑 10mm的扇貝籠中養(yǎng)成, 密度控制在每層50—60個。

1.4 測定指標

殼高小于 400μm 的幼蟲在顯微鏡下用目微尺(10×)測量, 殼長大于 3.0mm 的子代和親本用游標卡尺測量, 精確值0.02mm。每個實驗組設3個重復, 每個重復隨機測量30個個體。

1.5 數(shù)據(jù)分析

為了保證方差齊性, 所有的殼高進行以 10為底的對數(shù)轉(zhuǎn)化。用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理, 不同實驗組間數(shù)據(jù)的比較采用雙因素方差分析方法(Two-way ANOVA), 用Turkey法進行組間多重比較, 差異顯著性設置為P＜0.05。

參照 Zheng等(2006)使用的方法, 將兩個品系熊本牡蠣子二代的選擇反應(Selected reaction, SR)、現(xiàn)實遺傳力(hR2)及遺傳改進量(Genetic gain, GG)用以下公式計算

公式(1)、(2)和(3)中: XSG2和 XCG2分別是選擇組(SG2)和對照組(CG2)個體的平均殼高, SCG2是對照組(CG2)的標準差, i是選擇強度。

為了確定品系來源及其選擇效應對生長性狀的影響, 參照 Zhang等(2007)方法, 利用雙因子分析模型檢測品系來源(strain origin, SO)及選擇效應(selective effect, SE)對各實驗組子代殼高的影響

式中: Yijk為k個重復i個品系j種選擇下的殼高(存活率); μ為常數(shù); SOi為殼高的品系來源(i=1, 2); SEj為殼高的選擇效應(j=1, 2); (SO×SE)ij為品系與選擇效應的交互作用; eijk為隨機誤差(k=1, 2, 3)。

2 結(jié)果

2.1 殼高大小

幼蟲期, 3日齡時, 多嵴品系選擇組殼高顯著大于其它實驗組(P＜0.05); 9—15日齡期間, 多嵴品系選擇組殼高顯著大于無嵴品系對照組, 而多嵴品系對照組與無嵴品系無顯著差異(P＞0.05)。經(jīng)過雙因子分析模型分析, 品系來源及其選擇效應均對子二代幼蟲殼高造成了顯著影響, 15日齡時二者間的交互作用也造成了顯著影響(P＜0.05)。稚貝期(30—60日齡),多嵴品系選擇組殼高顯著大于無嵴品系對照組, 而其它兩個實驗組間無顯著差異(P＞0.05)。在此期間,選擇效應對子二代殼高具有顯著影響。養(yǎng)成期,90—180日齡期間, 多嵴品系選擇組殼高一直顯著大于無嵴品系對照組(P＜0.05); 360日齡時, 多嵴品系選擇組顯著大于其它三個實驗組, 無嵴品系選擇組顯著大于相應對照組(P＜0.05), 表現(xiàn)出明顯的選擇效果。180—360日齡期間, 品系來源及其選擇效應均對子二代殼高具有顯著影響(P＜0.05), 二者間交互作用尚未發(fā)生顯著影響(表1, 2)。

2.2 遺傳參數(shù)

從遺傳參數(shù)上看, 兩個品系選擇反應、現(xiàn)實遺傳力均表現(xiàn)為幼蟲期＜稚貝期＜養(yǎng)成期。多嵴、無嵴品系幼蟲期的選擇反應分別為0.47±0.12、0.34±0.06, 稚貝期為 0.65±0.05、0.40±0.05, 養(yǎng)成期為 0.82±0.07、0.56±0.07; 幼蟲期的現(xiàn)實遺傳力為 0.27±0.07、0.19±0.04, 稚貝期為 0.37±0.03、0.23±0.03, 養(yǎng)成期為 0.47±0.04、0.32±0.04。從其遺傳改進量上看, 多嵴、無嵴品系品系幼蟲期為 4.83%±1.01%、3.61%±0.71%, 稚貝期為7.55%±0.40%、5.76%±0.22%, 養(yǎng)成期為9.95%±0.18%、6.47%±0.13%。經(jīng)過一周年的養(yǎng)成, 多嵴、無嵴品系的選擇反應、現(xiàn)實遺傳力和遺傳改進量分別為0.88、0.62, 0.50、0.35, 10.13%、6.61% (表 3, 圖 2)。

表1 兩個品系子二代選擇組和對照組殼高Tab.1 Shell height of the control and selective groups in different ages

表2 品系來源(SO)及選擇效應(SE)對其子二代生長性狀影響的方差分析Tab.2 Analysis of variance showing the strain origin (SO) and selective effects (SE) on growth for each experimental group

表3 兩個品系子二代的選擇反應(SR)、現(xiàn)實遺傳力(hR2)及遺傳改進量(GG)Tab.3 Response to selection (SR), realized heritability (hR2)and genetic gain (GG) of the two oyster strains

3 討論

3.1 親本差異

本研究中, 通過設置親本子代對照組來計算遺傳參數(shù), 非用親本本身, 這主要是因為貝類的生長經(jīng)常受到環(huán)境效應影響, 如水質(zhì)、餌料、水流等影響著貝類的生長性能(Zhenget al, 2004, 2006; 李冬春等,2013)。研究中發(fā)現(xiàn), 兩個品系子一代的殼高就存在著顯著差異, 即多嵴品系子一代顯著大于無嵴品系, 且其選擇反應均較高(張躍環(huán)等, 2016), 所以子二代還存在著一定程度的遺傳改良效應。為此, 我們進行了兩個品系的子二代連續(xù)上選。

3.2 遺傳改進量

經(jīng)過兩代連續(xù)上選, 兩個品系遺傳改進量存在著分歧, 多嵴品系遺傳改進量一直大于無嵴品系, 尤其是到了360日齡時, 多嵴品系和無嵴品系遺傳改進量分別為10.13%、6.61%。這種分歧可能與品系內(nèi)遺傳多樣性變化水平有關, 也就是說多嵴品系內(nèi)遺傳多樣性水平較高, 而無嵴品系內(nèi)遺傳多樣性水平較低(Liet al, 2011; Wanget al, 2012)。在貝類連續(xù)選擇中, Newkirk等(1982)認為歐洲牡蠣生長選擇每代提高 10%—20%是合理的; Nell等(1999)對悉尼巖牡蠣體重進行了連續(xù)兩代選擇, 獲得了17.8%的遺傳改進量; Zheng等(2006)對海灣扇貝進行了兩代連續(xù)上選,發(fā)現(xiàn)新引進的海灣扇貝群體可以獲得 10%左右的遺傳改進量; 張國范等(2010)對菲律賓蛤仔進行中日韓三個群體的連續(xù)兩代的混合選擇, 獲得了 10%左右遺傳改進量; 王慶志(2011)對長牡蠣進行了中日韓三個地理群體的三代混合選擇, 每代均獲得了 10%的遺傳改進量。由此可見, 本研究中子二代獲得遺傳改進量處于較低水平, 這可能與熊本牡蠣自身個體較小, 生長緩慢有著直接關系。

圖2 兩個品系不同階段平均的選擇反應(SR)、現(xiàn)實遺傳力(hR2)及遺傳改進量(GG)Fig.2 Response to selection (SS), realized heritability (hR2) and genetic gain (GG) of the two oyster strains in different stages

3.3 遺傳參數(shù)

從遺傳參數(shù)看, 在整個生活史中, 多嵴品系的選擇反應及現(xiàn)實遺傳力均高于無嵴品系, 尤其是經(jīng)過周年養(yǎng)成的成體, 二者間差異明顯。我們分析, 這可能是兩個品系間的遺傳多樣性水平差異不同, 多嵴品系中仍存在著較大的遺傳方差, 大的遺傳方差暗示蘊藏著大的遺傳力, 遺傳力大, 遺傳改進量相對較多, 這也是多嵴品系遺傳改進量較多的原因(Zheng et al, 2004, 2006; 馬愛軍等, 2012)。此外, 在熊本牡蠣野生群體中, 多嵴類型占據(jù)大多數(shù), 無嵴類型相對較少, 可能導致無嵴品系遺傳多樣性水平較低。

與其子一代選擇相比, 多嵴品系的現(xiàn)實遺傳力較高, 說明還具有較大的選擇空間; 而無嵴品系的現(xiàn)實遺傳力相對居中, 較一代選擇時結(jié)果略有下降, 這可能是遺傳多樣性水平變化小, 或者不存在較大的效應基因?qū)е碌?張國范等, 2009; 張躍環(huán)等, 2014)。經(jīng)過雙因子模型分析發(fā)現(xiàn), 兩個品系經(jīng)過一周年的養(yǎng)成, 仍存在著顯著的生長分歧, 這也說明熊本牡蠣多嵴品系子二代具有較好的遺傳改良效應, 連續(xù)上選的效果是顯著的。

4 結(jié)論

本文發(fā)現(xiàn)經(jīng)過連續(xù)兩次的上選, 兩個品系生長性狀仍具有較高的選擇反應, 且多嵴品系的遺傳參數(shù)及遺傳改進量均明顯大于無嵴品系, 出現(xiàn)了遺傳分歧, 這也說明多嵴品系仍具有較好的遺傳改良前景。本文為熊本牡蠣遺傳改良和新品種培育奠定了理論與實踐基礎。

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