王祖忠 王朝陽 張迪駿 司開學 董麗莎 張紅燕 崔晨茜 韓姣姣 周 君 蘇秀榕

(寧波大學海洋學院 寧波 315211)

弓形桿菌(Arcobacter. sp)又稱為類彎曲菌(Campylobacter-like), 與類彎曲菌形態(tài)相似, 親緣關系很近, 呈彎曲或螺旋形桿狀, 不產芽孢, 最佳生長氧氣濃度為微量氧氣(3%—10%), 正常大氣氧濃度條件和厭氧條件下也可以生長。目前已發(fā)現(xiàn) Arcobacter有15個種, 其中有9種分離自環(huán)境中, 例如, 四聯(lián)球弓形桿菌(Arcobacter halophilus)、埃利斯弓形桿菌(A.ellis)和硝化弓形桿菌(A. nitrofigilis)等(Levican et al,2013)。弓形桿菌屬最高生長溫度為40°C, 被認為最低生長溫度為15°C, 最佳生長溫度為25—30°C (Houf et al, 2007; 游淑珠等, 2011)。弓形桿菌屬主要分離于豬肉、牛肉、禽肉等動物和水體中, 是一種人畜共患病的食源性和水源性病原菌, 與人類胃腸炎和菌血癥有關。

梭菌屬是能形成芽孢、厭氧生長的革蘭氏染色陽性大桿菌。通常多形態(tài), 以周生鞭毛運動, 芽孢橢圓或球形孢囊膨大。大多數(shù)為化能異養(yǎng)菌, 有的是化能自養(yǎng)菌或無機化能異養(yǎng)菌?？梢苑纸馓恰⒌鞍踪|, 通?？梢援a生混合的有機酸和醇類, 不還原硫酸鹽。它們的代謝物極富多樣性, 廣泛分布在環(huán)境中, 許多種可產生外毒素危害人類和牲畜生命健康。例如破傷風梭菌, 一般通過深部創(chuàng)傷感染, 產生痙攣毒素, 引起破傷風(Sheffield et al, 2004); 肉毒梭菌, 容易在魚貝類腸道、腮和內臟中生長, 在適宜條件下能產生肉毒毒素, 人進食這些含毒素食品后, 即發(fā)生肉毒中毒。弓形桿菌屬和梭菌屬作為危害人類身體健康的病原菌, 一直是研究熱點問題之一, 但目前主要集中在水體和食品方面, 陸源排污口中的弓形桿菌屬和梭菌屬未見報道。本文選取寧波沿海10個主要的陸源排污口 20個站位的水樣進行分析, 研究陸源排污口弓形桿菌屬和梭菌屬生物種類和分布特點。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

分別于2011年3月、5月、8月、10月, 在寧波沿海 5個工業(yè)型排污口(S1象山爵溪東塘排污口,S3象山石浦水產加工園區(qū)排污口, S4象山西周工業(yè)園區(qū)排污口, S5象山墻頭綜合排污口, S7寧海西店崔家綜合排污口, S10余姚黃家埠排污口), 3個排污河型排污口(S6北侖三山排污口, S8奉化下陳排污口,S9寧海顏公河入海排污口)和1個市政型排污口(S2象山水桶岱垃圾場排污口)以及距離排污口 50m 以外的 10個站位點處采集表面水層(圖 1), 采用微生物采水器, 每次采集 4L水樣, 注入無菌采樣瓶中,4°C下保存。

圖1 陸源排污口的名稱和地理位置Fig.1 The name and location of the land-based sewage outfall

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取采集的排污口的海水用0.22μm 的微孔濾膜富集微生物, 利用試劑盒提取基因組 DNA(美國Omega生物技術公司)。

1.2.2 PCR擴增 根據(jù)細菌16S rRNA的保守序列,利用 Primer Premier 5.0設計擴增引物： 16SF (5′-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3′)和16SR (5′-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG-3′)。

20μL 擴增反應體系： 2μL 10×buffer, 2μL MgCl2,2μL dNTP, 上游引物和下游引物各 25μL, 0.2μL Taq DNA聚合酶和1μL DNA模版。PCR擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(張迪駿等, 2013; 陳麗萍等,2013)。

PCR擴增條件： 94°C預變性4min, 94°C變性30s,退火溫度從65°C到55°C, 退火30s, 20個循環(huán); 72°C延伸30s, 94°C變性30s, 55°C退火30s, 72°C延伸30s, 35個循環(huán); 最終72°C延伸10min(劉兵等, 2009)。

1.2.3 測序與分析 將純化后的 PCR產物進行454焦磷酸測序(王中華等, 2014; Wang et al, 2014),結果用羅氏軟件2.5.3進行信號處理分析。根據(jù)細菌在文庫中出現(xiàn)的頻次數(shù)量, 進一步用 R For Window 2.15.2、SPSS等進行統(tǒng)計分析。

2 結果與討論

2.1 排污口中弓形桿菌屬和梭菌屬的種類

通過454高通量測序的結果分析, 共檢測出弓形桿菌屬 2個種, 分別是嗜低溫弓形桿菌(A.cryaerophilus)、布氏弓形桿菌(A. butzleri); 梭菌屬12個種, 分別是產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、丁酸梭菌(C. butyricum)、多枝梭菌(C. ramosum)、嗜纖維桿菌(C. cellulovorans)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、熱纖維梭菌(C. thermocellum)、破傷風梭菌(C. tetani)雙酶梭菌(C. bifermentans)、類腐敗梭菌(C. paraputrificum)、近端梭菌(C. subterminale)、巴氏梭菌(C. pasteurianum)、柔嫩梭菌(C. leptum)。其中弓形桿菌屬的嗜低溫弓形桿菌、布氏弓形桿菌和梭菌屬的產氣莢膜梭菌、丁酸梭菌為優(yōu)勢菌種。

2.2 弓形桿菌屬和梭菌屬排污口分布特點

弓形桿菌屬分別是3月份S1、S2和S8站點; 5月份S2、S3和S5站點; 8月份S2、S3站點和10月份S1、S2與S3站點的優(yōu)勢菌屬。由圖2可以看出, 弓形桿菌屬主要分布在工業(yè)排污口和市政排污口, 而在排污河類型的排污口檢出次數(shù)很少。這也與許小紅等(2009)在對菜市場污水細菌多樣性分析的結果一致,該研究認為弓形桿菌屬在菜市場污水中所在的比例最高, 高達 27.6%, 而市政排污口的污水來源于生活污水。工業(yè)排污口和市政排污口的污染物中氮氨、磷酸鹽的含量比較高, 而排污河類型的排污口處氮、磷含量相對較低, 因此推測工業(yè)排污口和市政排污口處的較高的氮、磷含量造成了弓形桿菌屬的大量繁殖。

圖2 弓形桿菌屬在排污口的分布情況Fig.2 Distribution of Arcobacter in outlet

對比弓形桿菌屬, 梭菌屬卻只在3月份的S7站點呈現(xiàn)出相對較高的比例(7.5%), 在其它月份、站點均不是優(yōu)勢菌屬, 所占比例均在2%以下(圖3)。王想霞等(2000)在對濮陽市肉毒梭菌生態(tài)分布的研究中也得出相應的結論, 其研究結果顯示, 肉毒梭菌在土壤中的分布最高, 達到 14.6%, 而污水的分離比率卻只有 4.7%, 說明肉毒梭菌的主要分布區(qū)域是土壤, 而非污水(王想霞等, 2000)。同樣, 石家莊市肉毒梭菌在環(huán)境中的分布也呈現(xiàn)相同的趨勢, 土壤中肉毒梭菌的分離比率為 5.3%, 要高于水樣 2.0%(郭占景等,2010)。

從弓形桿菌屬的分布看, S1站點與S2站點、S4站點與S5站點和S6站點與S8站點的分布情況最為接近, 而從梭菌屬的分布看, S2站點與S3站點、S4站點與S5站點、S6與S8站點和S10站點和S7站點的分布情況最為接近(圖 4), 結合弓形桿菌和梭菌屬的站點聚類結果, 發(fā)現(xiàn)無論是弓形桿菌屬還是梭菌屬, S4站點與S5站點, S6站點與S8站點的分布均呈現(xiàn)出高度相似的特點。從排污口的類型上看, S4站點與S5站點是工業(yè)性排污口, S6站點與S8站點都是排污河, 因此可以推測弓形桿菌屬和梭菌屬的分布與排污口的類型存在較密切的聯(lián)系。

2.3 弓形桿菌屬和梭菌屬排污口分布相關性分析

數(shù)據(jù)的SPSS分析發(fā)現(xiàn)(表1), 梭菌屬和弓形桿菌屬的偏度和峰態(tài)均大于 1, 不符合正態(tài)分布, 故對兩者進行相關性分析時, 采用 Spearman相關性分析方法, 分析結果顯示梭菌屬和弓形桿菌屬的相關性系數(shù)為0.536, 顯著性(雙邊檢驗)為小于0.05, 說明兩者數(shù)據(jù)之間呈現(xiàn)正相關性, 且相關性具有統(tǒng)計學意義。

圖3 梭菌屬在排污口的分布情況Fig.3 Distribution of Clostridium in outlet

圖4 站點聚類分析圖Fig.4 The cluster analysis of sites

表1 弓形桿菌屬和梭菌屬描述性統(tǒng)計結果Tab.1 Descriptive statistics result of Arcobacter and Clostridium

2.4 弓形桿菌屬和梭菌屬在排污口處的分布與時間關系

3月份, 弓形桿菌屬在 S1象山爵溪東塘排污口檢出次數(shù)最高(444次)。梭菌屬在S7寧海西店崔家綜合排污口檢出次數(shù)最高(211次); 5月份, 弓形桿菌屬在S5象山墻頭綜合排污口檢出次數(shù)最高(4122次)。梭菌屬在S2象山水桶岱垃圾場排污口檢出次數(shù)最高(189次); 8月份, 弓形桿菌屬在S3象山石浦水產加工園區(qū)排污口檢出次數(shù)最高(467次), 其它排污口檢出次數(shù)均相對較低。梭菌屬S3象山石浦水產加工園區(qū)排污口檢出次數(shù)最高(25次); 10月份, 弓形桿菌屬在S3象山石浦水產加工園區(qū)排污口檢出次數(shù)最高(541次)。梭菌屬在S7寧海西店崔家綜合排污口檢出次數(shù)最高(13次)(圖 5, 圖 6)。

弓形桿菌屬最適生長溫度為 25—30°C, 在 37°C和 42°C 下生長不良, 4°C 下幾乎不生長(畢水蓮等,2013), 2011年寧波5月份日均最低溫度為17°C, 最高溫度為 25°C, 另外 S5排污口屬于工業(yè)型排污口, 污染物中含有大量的無機氮和活性磷酸鹽, 從而造成弓形桿菌屬的大量生長, 其在5月份, S5排污口的檢出量明顯高于其它月份。寧波8月份日均最低溫度為25°C, 日均最高溫度為 32°C, 但是由于高溫使部分企業(yè)停工, 污水排放量減少, 沒有造成弓形桿菌屬大量繁殖(謝利等, 2016)。梭菌屬適宜生長溫度范圍較廣, 為10—65°C, 其在3月份, S7號排污口檢出量最多, S7號排污口為工業(yè)型排污口, 污染物中含有大量的氮、磷, 有利于梭菌屬的生長。但是梭菌屬不適宜在水中生長, 主要廣泛存在于土壤, 淤泥及人和動物腸道中(Stewart et al, 1990; 鄧志愛等, 2006), 所以各個月份與弓形桿菌屬相比檢出量均較低。

圖5 弓形桿菌屬各月份的分布情況Fig.5 Distribution of Arcobacter in each month

弓形桿菌屬是一類人畜共患的食源性和水源性病原菌(Ho et al, 2006), 可導致人類胃腸炎和菌血癥, 引起的胃腸炎的臨床病癥與彎曲桿菌病類似(畢水蓮等, 2009)。低溫弓形桿菌和布氏弓形桿菌主要寄生在動物性食物中, 尤其是雞肉(Rivas et al,2004), 其中布氏弓形桿菌被認為造成腹瀉疾病的第四大病原菌(Ferreira et al, 2014), 梭菌屬主要通過外毒素的方式, 引起人畜共患病, 例如產氣莢膜可共產生 12種毒素, 主要造成人畜腸胃患病(陳小云, 2005), 而肉毒梭菌易于通過污染食物而引起人畜患病。因此, 采取以預防為主的手段是非常必要的, 可以從消滅或者減少食物鏈中的弓形桿菌屬和梭菌屬入手, 按照不同菌種在不同月份的生長特點對排污口進行重點監(jiān)控。

3 結論

利用454高通量測序技術發(fā)現(xiàn), 寧波沿海2個重點排污口、8個一般排污口的 20個站位的弓形桿菌屬有2個種和梭菌屬有12個種。弓形桿菌屬比較適合在工業(yè)型和市政型污水生長, 而梭菌屬只有3月份的 S7號排污口檢出量較高, 其它排污口均較低。弓形桿菌屬和梭菌屬的分布與排污口的類型有著較密切的聯(lián)系, 相同類型的排污口有著高度相似分布特點。季節(jié)性不同而引起的溫度差異, 也會引起兩種微生物生長狀態(tài)的變化, 弓形桿菌屬受溫度影響較大,梭菌屬適宜生長溫度范圍較大, 而且兩者的分布數(shù)據(jù)呈現(xiàn)正相關性。弓形桿菌屬和梭菌屬都容易通過水源和食物鏈危害人類健康, 弓形桿菌屬容易造成人體腸胃炎和腹瀉等疾病, 梭菌屬可以造成多種由其外毒素引起的疾病, 如破傷風, 惡性水腫和腸毒血癥等疾病, 所以應該依照不同季節(jié)和不同類型的排污口針對性地對兩種微生物進行監(jiān)控和治理, 防止污染水體和其它水生生物。

圖6 梭菌屬各月份的分布情況Fig.6 Distribution of Clostridium in each month

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