?綜述與述評?

半胱氨酸保護基研究進展

黃蓓

(河南省化工研究所有限責任公司 ， 河南 鄭州450052)

摘要：由半胱氨酸構建的二硫鍵在多肽藥物中是一類關鍵的結構元素。在合成含有半胱氨酸的多肽藥物時，半胱氨酸的巰基必須要被保護基保護起來，否則，具有親核性的巰基會發(fā)生許多副反應。本文介紹了半胱氨酸各種類型的保護基及其相應的脫除條件。

關鍵詞：半胱氨酸 ； 保護基 ； 二硫鍵

中圖分類號：TQ464.7

收稿日期：2015-05-05

作者簡介：黃蓓(1982-)，女，工程師，從事催化研發(fā)工作，電話：15237129810。

Research Progress of Cysteine-protecting Groups

HUANG Bei

( Henan Chemical Industry Research Institute Co.Ltd , Zhengzhou450052 , China)

Abstract:Disulfide bonds,which formed by cysteine,are key structural elements in many therapeutically peptides.Protection of the side chain of cysteine is mandatory in therapeutically peptides synthesis otherwise the nucleophilic thiol will take place some side reactions.A variety of protecting groups of cysteine and its corresponding removal of conditions are introduced in this paper.

Key words:cysteine ; protecting group ; disulfide bond

0前言

多肽是一類普遍存在于生物體內(nèi)由氨基酸通過肽鍵連接組成的化學物質(zhì)，迄今在生物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)多達數(shù)萬種的多肽分子。由于其具有獨特的生物活性，多肽在治療癌癥等疑難病上起到良好的效果，因此，近年來吸引了越來越多的制藥企業(yè)投入到多肽藥物的研究和開發(fā)中。

分子骨架中有一對或多對由半胱氨酸構建的二硫鍵的多肽分子是多肽類藥物中一類具有更加獨特生物活性的分子。在合成含有半胱氨酸的多肽藥物時，側鏈含有的半胱氨酸是必須要被保護基保護的，否則其含有的具有高親核性的巰基將有可能發(fā)生酰基化、烷基化或者被空氣氧化形成二硫鍵等副反應[1]。

由半胱氨酸構建的二硫鍵這一關鍵結構存在于許多具有潛在藥理活性的多肽藥物中，為了使這些潛在藥物真正被應用到實際治療疾病過程中或者臨床前期的評估中，目前大量的研究和優(yōu)化工作已經(jīng)開展[2]。

然而對于肽鏈中含有多個半胱氨酸的多肽藥物，在構建多個二硫鍵時將會遇到一個困難，即如何能保證做到按照分子設計的那樣清晰明了地構建相應的二硫鍵。為了解決這個問題，就需要在肽鏈合成中選擇合適的保護基對不同位點的半胱氨酸進行正交保護，從而實現(xiàn)逐步合成理想的多個二硫鍵的多肽藥物[3]。

1半胱氨酸保護基

1.1酸敏感保護基

1.1.1芐基及其取代芐基類

芐基及其取代芐基類衍生物是一類對酸敏感的半胱氨酸保護基，主要應用在Boc/Bn固相合成策略中。隨著芳環(huán)上取代基的不同，芐基類保護基對酸的敏感程度和脫除的難易也有比較大的區(qū)別。

芐基(Bn)的脫除需要比較苛刻的實驗條件(HF、25 ℃或者鈉在液體氨水中[4])才能實現(xiàn)；對甲基芐基(Meb)對酸相對比較敏感，脫除條件相對于芐基就比較溫和一點，只需要HF和捕獲劑在低溫下就可以實現(xiàn)脫除；而對甲氧基芐基(Mob)是一種比Meb對酸更加敏感的保護基，脫除它只需要HF和捕獲劑在零度條件下就可實現(xiàn)，同時也發(fā)現(xiàn)Mob作為保護基的粗肽純度比用Meb作保護基的高[5]。

三甲氧基芐基(Tmob)也是一種對酸敏感的芐基類衍生物，但這個保護基主要應用于Fmoc/tBu的固相合成策略。脫除這個保護基只需要在稀的TFA和捕獲劑存在下就可以實現(xiàn)。然而值得注意的是脫除下來的三甲氧基芐基陽離子會與色氨酸(Trp)發(fā)生烷基化的副反應[6]。

由此可知，芐基及其衍生物對酸敏感度的相對關系：Mob > Meb > Bn，此類物質(zhì)的結構見圖1。

圖1　芐基及其取代衍生物保護基

1.1.2二苯甲基和三苯甲基類

三苯甲基類的半胱氨酸保護基是一類在Fmoc/tBu固相合成策略中比較經(jīng)典和常用的保護基。三苯甲基(Trt)可以用TFA(>25%濃度)和捕獲劑(例如三異丙基硅烷 TIS，為了阻止脫下來的三苯甲基陽離子再次與巰基反應)脫除[7]。而單甲氧基三苯基(Mmt)與Trt相比是一類對酸更加敏感的保護基，脫除Mmt保護基只需要在很稀的TFA(1%~5%濃度)和捕獲劑存在下就可實現(xiàn)[8]。另外，無論是Trt還是Mmt都可以在碘作用下一步實現(xiàn)脫除和

氧化形成二硫鍵。

然而在一些實驗中發(fā)現(xiàn)，當Trt和Mmt被用作正交半胱氨酸保護基時，用1%的TFA脫除Mmt時并不能徹底脫除，而正交的Trt保護基卻發(fā)現(xiàn)被部分脫除，這種現(xiàn)象就導致最終不能得到較好的產(chǎn)品純度和收率。因此，近年又發(fā)展了一種二苯甲基的保護基(Dpm)，脫除此保護基需要比較高濃度的TFA(> 60%)才能實現(xiàn)[9]。這樣當Dpm與Trt或者Mmt同時使用時，就能起到很好的正交結果。此類物質(zhì)的結構如圖2所示。

圖2　三苯甲基類和二苯甲基保護基

1.1.3叔丁基類

叔丁基(tBu)和含有叔丁基骨架的半胱氨酸保護基(1-Ada)(如圖3所示)在TFA條件下非常穩(wěn)定，因此此類保護基主要應用與Boc/Bn固相合成策略中[10]。脫除這類保護基需要用HF在相對高溫和捕獲劑條件下才能實現(xiàn)。

圖3　叔丁基類保護基

1.2堿敏感保護基

堿敏感的半胱氨酸保護基主要有芴甲基(Fm)、2，4-二硝基-苯乙基(Dnpe)、芴甲氧羰基(Fmoc)、烯丙氧氣羰基(Alloc)這幾種(如圖4所示)，這些保護基只適合用于Boc/Bn固相合成策略中。

圖4　堿敏感類保護基

芴甲基(Fm)的脫除需要在50% piperidine/DMF中反應2 h，而如果用10% piperidine/DMF則需要反應過夜才能保證徹底脫除。此保護基對強酸有比較好的耐受性，即使在HF下也比較穩(wěn)定[11]。

Dnpe的脫除在50% piperidine/DMF中只需要30~60 min，值得強調(diào)的是在此條件下保護基被脫除的同時二硫鍵也隨之形成。如果想得到含有自由巰基的產(chǎn)物，就需要在脫除劑中加入額外的自由巰基分子如2-巰基乙醇[12]。

Fmoc保護基的脫除需要用三乙胺在碘作用下同時實現(xiàn)脫除和形成相應的二硫鍵，而且這種脫除方法并不會影響氨基的Fmoc保護基[13]。

Alloc保護基的脫除要用到金屬催化劑Pb(0)在Bu3SnH存在下，常用的金屬催化劑是Pd(PPh3)4[14]。

1.3酸、堿相對穩(wěn)定的保護基

酸、堿相對穩(wěn)定的保護基主要有乙酰氨甲基(Acm)、苯乙酰氨甲基(Phacm)、叔丁基硫基(StBu)三種(如圖5所示)，由于此類保護基對酸、堿的耐受性相對都比較好，因此既可以應用在Boc/Bn固相合成策略中也可以應用在Fmoc/tBu固相合成策略中。

Acm保護基可以在碘或者鉈鹽[15]的作用下一步實現(xiàn)脫除和二硫鍵的形成，用汞鹽或者銀鹽處理Acm保護基時可以得到含有自由巰基的產(chǎn)物。此外，也發(fā)現(xiàn)Acm保護基在HF條件下可以被部分脫除[16]。

Phacm與Acm的化學性質(zhì)非常相似，脫除Acm的條件同時也可以應用到此保護基中。另外，Phacm具有一個獨特的性質(zhì)，即可以被青霉素水解酶在非常溫和條件下脫除[16]。

StBu保護基的脫除需要用到額外的巰基，如苯硫酚、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇等。此保護基也可以被HF部分脫除[18]。

圖5　酸、堿穩(wěn)定的保護基

1.4光敏感保護基

光敏感半胱氨酸保護基發(fā)現(xiàn)和發(fā)展的一個主要原因，就是為了克服在苛刻條件下脫除半胱氨酸保護基時引起其它敏感基團發(fā)生副反應的可能性。因為光敏感保護基的脫除條件非常的溫和，只需要在溶液中光照(λ= 300~ 400 nm)條件下就可實現(xiàn)脫除，而不需要再額外添加任何試劑，這樣就最大程度地減少了其它敏感基團副反應發(fā)生的可能性。

目前常用的光敏感保護基主要有2-硝基-苯甲基(oNb)和2-硝基-4，5-二甲氧基-苯甲基(oNv)(如圖6所示)這兩種，此類保護基可應用與Boc/Bn和Fmoc/tBu兩種固相合成策略中。另外，相對于oNb，oNv由于在350 nm處有比較強的吸收，因此oNv光敏感保護基在實際應用中更受歡迎。

圖6　光敏感類保護基

1.5保護與活化功能兼具的保護基

在構建二硫鍵的時候此類保護基不僅起到保護半胱氨酸巰基的功能同時也具有活化巰基的特性。這樣的保護基以Npys18和S-Pyr19類為主(如圖7所示)，此類保護基由于對堿相對敏感，因此主要應用在Boc/Bn固相合成策略中。如果此類保護基是在肽鏈的N端時，也可以應用在Fmoc/tBu固相合成策略中。脫除這類保護基需要引入額外的自由巰基，因此如果肽鏈中含有二硫鍵的話可能存在二硫鍵被巰基斷開的風險。

圖7　保護和活化功能兼具的保護基

2結論與展望

采用化學方法合成多肽類物質(zhì)在生物化學中是一種非常重要的工具。然而開發(fā)更加有效的方法來構建復雜多肽分子依舊存在巨大的挑戰(zhàn)，其中一個挑戰(zhàn)就是如何準確地構建含有多個由半胱氨酸形成的二硫鍵的多肽分子，因為在合成此類多肽分子中，經(jīng)常會遇到不能按照分子設計的那樣準確地構建設定的二硫鍵分子，總是會有二硫鍵混雜現(xiàn)象的發(fā)生。而為了避免和解決這個問題，就需要在多肽合成中選用合適的保護基來進行正交保護半胱氨酸。

隨著新多肽藥物的發(fā)現(xiàn)和多肽技術的不斷更新，特別是在構建含有多個二硫鍵的多肽藥物時，對半胱氨酸保護基的正交選擇尤為重要。盡管目前半胱氨酸的保護基種類很多，但是發(fā)現(xiàn)和發(fā)展更加有效的以及脫除條件更加溫和的新的保護基始終是多肽藥物合成研究的重點。

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