張楊　王成昆　+彭波　朱歡　張志杰

[摘要] 目的 檢測(cè)趨化因子受體4（CXC chemokinereceptortype4，CXCR4）在各種乳腺癌組織及相應(yīng)正常乳腺組織中的表達(dá)并分析其臨床病理意義。 方法 組織芯片中標(biāo)本收集于2010年5月—2014年9月，應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)組織芯片中204例乳腺癌組織和36例正常乳腺組織CXCR4蛋白的表達(dá)，以棕色顆粒為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比進(jìn)行半定量處理。結(jié)果 CXCR4蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，在相應(yīng)正常乳腺組織、小葉原位癌、導(dǎo)管內(nèi)原位癌和浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的陽(yáng)性表達(dá)率依次升高，分別為8.3%（3/36）、25.0%（1/4）、10.0%（5/50）、72.0%（108/150），4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；在I、II和III級(jí)以上分級(jí)的乳腺癌組織中，CXCR4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為18.2%（2/11）、80.4%（78/97）、69.8%（30/43），3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；CXCR4蛋白在有轉(zhuǎn)移的腫瘤組織和無(wú)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中的陽(yáng)性率分別為88.4%（61/69）和11.1%（15/135）。結(jié)論 CXCR4在部分乳腺癌組織中高表達(dá)，且與乳腺癌組織類型及乳腺癌組織侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] CXCR4；乳腺癌；組織芯片；免疫組織化學(xué)法

[中圖分類號(hào)] R5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2015）11（c）-0014-03

[Abstract] Objective To detect the expression of CXC chemokine receptor 4 （CXCR4） in various breast cancer tissues and normal breast tissues and analyze its clinical pathological significance. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of CXCR4 protein in 204 cases of breast cancer tissues and 36 cases of normal breast tissues in the tissue microarray samples collected from May 2010 to September 2014. Using brown granules as the positive standard， staining intensity and percentage of positive cells in the total cell number were calculated for semi-quantitative treatment. Results CXCR4 protein was mainly expressed in cell membrane and cytoplasm. The positive expression rate of CXCR4 in normal breast tissues， lobular carcinoma in situ， intraductal carcinoma in situ， infiltrating ductal carcinoma was gradually increased， which was respectively 8.3%（3/36）， 25.0%（1/4）， 10.0%（5/50） and 72.0%（108/150）， and there was a significant difference between these 4 groups（P<0.001）. The positive expression rate of CXCR4 protein in the breast cancer tissues of stage I， II， III and over III was 18.2%（2/11）， 80.4%（78/97） and 69.8%（30/43）， respectively， there was significant difference between the 3 groups（P<0.001）. The positive rate of CXCR4 protein in metastatic tumor tissues and non-metastatic breast cancer tissues was 88.4%（61/69） and 11.1%（15/135）， respectively. Conclusion CXCR4 is highly expressed in some breast cancer tissues， and is closely related to the type of breast cancer and the invasion and metastasis of breast cancer.

[Key words] CXCR4； Breast cancer； Tissue microarray； Immunohistochemistry

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率和死亡率在我國(guó)呈上升趨勢(shì)。遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移是乳腺癌失敗的主要原因之一，然而學(xué)界對(duì)于乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制仍然不甚清楚。許多研究表明，腫瘤轉(zhuǎn)移與炎癥細(xì)胞趨化有著類似的過(guò)程。趨化因子可活化炎癥細(xì)胞并為之提供遷移信號(hào)、趨化其移動(dòng)并使之準(zhǔn)確定位于高濃度的炎癥因子區(qū)域。SDF-1（sclerotic stroma-derived factor 1）是骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生一種細(xì)胞因子，是趨化因子CXC家族的一員。研究顯示腫瘤組織間質(zhì)中含較高濃度的SDF-1，并且在部分腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中也發(fā)現(xiàn)SDF-1的高表達(dá)[1]。

CXCR4是SDF-1已知的唯一受體。SDF-1/CXCR4軸的活化可介導(dǎo)多種惡性腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織中CXCR4的表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移率呈正相關(guān)關(guān)系[2]；基因過(guò)表達(dá)技術(shù)發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞高表達(dá)CXCR4后其侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯高于親本細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)CXCR4在不同類型和分期的乳腺癌組織中表達(dá)存在差異，但是由于樣本來(lái)源單一，統(tǒng)計(jì)結(jié)果難免偏頗[3-4]；其次，CXCR4在乳腺癌中的差異表達(dá)與是否轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系不甚明晰。因此，2010年5月—2014年9月該研究擬以多中心來(lái)源的乳腺癌組織制作的組織芯片為檢測(cè)對(duì)象，運(yùn)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CXCR4在乳腺癌組織芯片中的表達(dá)，分析CXCR4表達(dá)量與乳腺癌組織分型分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 組織芯片

3套乳腺癌組織芯片購(gòu)自西安艾麗娜生物科技有限公司，編號(hào)分別為BR10010c，BR8011和BC081120a。標(biāo)本收集于2010年5月—2014年9月，共有正常乳腺組織36例和腫瘤組織204例，其中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織150例、導(dǎo)管內(nèi)原位癌組織50例、小葉原位癌組織4例；其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例69例；年齡27～81歲，平均年齡（47.9±10.5）歲。

1.2 方法

濃縮型羊抗人CXCR4抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。超敏SP（抗羊）試劑盒和DAB顯色試劑購(gòu)自福州邁新公司。組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、水化后，PBS洗3次各5 min；每張切片加100 μL 3%過(guò)氧化氫，孵育10 min，PBS沖洗3次，3 min/次，除去PBS液；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min；每張切片加100 μL的CXCR4抗體（1：200稀釋），在4℃下孵育過(guò)夜。37℃復(fù)溫45 min，PBS沖洗3次，3 min/次。滴加羊抗鼠Ⅱ抗100 μl，孵育1 h；PBS洗3次各5 min；DAB顯色1～5 min，在顯微鏡下掌握染色程度；PBS或自來(lái)水沖洗10 min；蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化；自來(lái)水沖洗10～15 min；脫水、透明、封片、照相。結(jié)果判定：綜合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比進(jìn)行半定量處理：無(wú)染色（-）為0分，染色弱（+）為1分，染色強(qiáng)呈棕黃色（++）為2分，染色很強(qiáng)深棕色（+++）為3分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%～50%者為2分，51%～80%者為3分，﹥80%者為4分。上述兩項(xiàng)評(píng)分相乘：不管其染色強(qiáng)度，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)﹤10%為（-），3分為（+），4～5分為（++），6～9分為（+++）。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用百分比（%）表6示，采用χ2檢驗(yàn)，以P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

CXCR4在正常乳腺組織、導(dǎo)管內(nèi)原位癌組織、小葉原位癌組織、浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織（圖1）中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為8.3%（3/36）、25.0%（1/4）、10.0%（5/50）、72.0%（108/150），4組間陽(yáng)性表達(dá)率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。CXCR4蛋白在不同級(jí)別的乳腺癌組織中的陽(yáng)性率分別為I級(jí)18.2%（2/11）、II級(jí)80.4%（78/97）、III級(jí)以上69.8%（30/43），3組間陽(yáng)性表達(dá)率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；CXCR4蛋白在有轉(zhuǎn)移的腫瘤組織和未發(fā)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)移證據(jù)的乳腺癌組織中的陽(yáng)性率分別為88.4%（61/69）和11.1%（15/135），兩組間陽(yáng)性表達(dá)率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；但CXCR4蛋白的表達(dá)在不同年齡（<60歲或≥60）的乳腺癌患者中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

3 討論

SDF-1的趨化作用由CXCR4來(lái)介導(dǎo)。CXCR4在正常乳腺組織、乳腺、卵巢、前列腺表達(dá)很弱，但在乳腺癌和結(jié)腸癌中高表達(dá)[5]，同時(shí)在乳腺癌中也發(fā)現(xiàn)CXCR4表達(dá)，并且在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞株和轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞株中具有高表達(dá)[6]。對(duì)前列腺癌組織研究發(fā)現(xiàn)CXCR4蛋白表達(dá)升高與腫瘤的轉(zhuǎn)移正相關(guān)[7]。表達(dá)CXCR4的腫瘤細(xì)胞在SDF-1的作用下從原發(fā)部位游走出來(lái)后通過(guò)血道和淋巴道向遠(yuǎn)端組織轉(zhuǎn)移并形成轉(zhuǎn)移灶。在前列腺癌、乳腺癌研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞沿著SDF-1濃度梯度向高濃度遷徙，形成轉(zhuǎn)移灶。因此普遍認(rèn)為，CXCR4的表達(dá)不僅是上皮細(xì)胞惡性程度的主要特征之一，也可作為腫瘤轉(zhuǎn)移能力的判斷指標(biāo)[8]。CXCR4與SDF-1結(jié)合，可以增加腫瘤細(xì)胞黏附能力和侵襲性，并分泌多種血管生成因子[9]。Tamamura等[10]發(fā)現(xiàn)SDF-1/CXCR4軸在乳腺癌轉(zhuǎn)移發(fā)生中具有明顯作用。在體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞中加入SDF-1，癌細(xì)胞的增殖和侵襲力明顯加強(qiáng)，并且轉(zhuǎn)移能力也明顯上升；用CXCR4單抗處理后，癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力都受到抑制。

既往曾有幾項(xiàng)研究關(guān)注CXCR4的表達(dá)與乳腺癌轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后生存的關(guān)系，并指出CXCR4的表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且SDF-1/CXCR4軸的激活與患者預(yù)后成負(fù)相關(guān)[11-12]。但是，我們注意到這些研究的標(biāo)本來(lái)源比較單一，為一個(gè)市級(jí)地區(qū)患病人群；雖然樣本量有上百例，但仍然有數(shù)據(jù)偏畸可能。因此該研究一改既往從地區(qū)醫(yī)院取材的限制[13]，轉(zhuǎn)而采用西安艾莉娜公司的多張乳腺癌組織芯片進(jìn)行研究，這些芯片來(lái)源于多個(gè)地區(qū)的多個(gè)醫(yī)療機(jī)構(gòu)，總樣本量達(dá)到204例，符合多中心研究的基本要求。該研究發(fā)現(xiàn)CXCR4蛋白在不同年齡和性別的乳腺癌組織中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是，CXCR4蛋白在不同病理類型的乳腺癌中存在表達(dá)差異：浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織>導(dǎo)管內(nèi)原位癌組織>小葉原位癌組織；其中在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率最高（72%）；在不同級(jí)別的乳腺癌組織中CXCR4蛋白的表達(dá)也存在差異，在分化程度較低的組織中表達(dá)較高，提示CXCR4蛋白的表達(dá)可能與乳腺癌組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)關(guān)系。最后，該研究對(duì)CXCR4蛋白表達(dá)與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果提示在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中CXCR4的表達(dá)比率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

該研究檢測(cè)了CXCR4在各類型乳腺癌組織表達(dá)差異并分析了CXCR4的表達(dá)與病理類型和腫瘤轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，為研究CXCR4在腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移中所起作用并為進(jìn)一步探索乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Zeelenberg IS， Ruuls-Van SL， Roos E. The chemokine receptor CXCR4 is required for outgrowth of colon carcinoma micrometastases[J].Cancer Res，2003，63（13）：3833-3839.

[2] Platt D， Amara S， Mehta T， et al. Violacein inhibits matrix metalloproteinase mediated CXCR4 expression： potential anti-tumor effect in cancer invasion and metastasis[J].Biochem Biophys Res Commun，2014，455（1-2）：107-112.

[3] Douglass S， Meeson AP， Overbeck-Zubrzycka D， et al. Breast cancer metastasis： demonstration that FOXP3 regulates CXCR4 expression and the response to CXCL12[J].J Pathol，2014，234（1）： 74-85.

[4] hang Z， Ni C， Chen W， et al. Expression of CXCR4 and breast cancer prognosis： a systematic review and meta-analysis[J].BMC Cancer，2014（14）：49.

[5] Oliveira FV， Rubie C， Ghadjar P， et al. Changes in CXCL12/CXCR4-chemokine expression during onset of colorectal malignancies[J].Tumour Biol，2011，32（1）：189-196.

[6] Hinton CV， Avraham S， Avraham HK. Role of the CXCR4/CXCL12 signaling axis in breast cancer metastasis to the brain[J].Clin Exp Metastasis，2010，27（2）： 97-105.

[7] Akashi T， Koizumi K， Tsuneyama K， et al. Chemokine receptor CXCR4 expression and prognosis in patients with metastatic prostate cancer[J].Cancer Sci，2008，99（3）：539-542.

[8] Ehtesham M， Stevenson CB， Thompson RC. Preferential expression of chemokine receptor CXCR4 by highly malignant human gliomas and its association with poor patient survival[J].Neurosurgery，2008，63（4）：820.

[9] Wang J， Wang J， Sun Y， et al. Diverse signaling pathways through the SDF-1/CXCR4 chemokine axis in prostate cancer cell lines leads to altered patterns of cytokine secretion and angiogenesis[J].Cell Signal，2005，17（12）： 1578-1592.

[10] Tamamura H， Hori A，Kanzaki N， et al. T140 analogs as CXCR4 antagonists identified as anti-metastatic agents in the treatment of breast cancer[J].FEBS Lett，2003，550（1-3）： 79-83.

[11] 孔令禹，余之剛，薛梅，等.乳腺癌組織SDF-1/CXCR4表達(dá)與預(yù)后相關(guān)性分析[J].中華腫瘤防治雜志，2014（8）： 605-611.

[12] 劉鳳磊，趙鳳輝，王金穗，等. 乳腺癌CXCL12及其受體CXCR4的表達(dá)及意義[J].診斷病理學(xué)雜志，2013（6）： 336-339.

[13] 張楊，黃麗，楊齊，等.CXCR4在肺癌組織芯片中的表達(dá)及其臨床意義[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2012，10（36）： 448-450.

（收稿日期：2015-08-27）