網(wǎng)絡出版時間：2014-12-4 13:45網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.009.html

腦室給予不同劑量的Capsazepine對LPS致大鼠發(fā)熱過程的影響

Bibek Khanal，施蓓，Puja Paudel, 張璠, 秦鑫，曹宇

(中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學教研室，遼寧 沈陽110001)

中國圖書分類號：R-332；R322.81；R392.11；R441.3；R977.6

摘要：目的在大鼠側腦室內給予不同劑量的瞬時受體電位香草酸受體1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)拮抗劑Capsazepine，觀察對LPS致熱過程的影響。方法在側腦室內預先給與3種劑量Capsazepine，隨之腹腔給與LPS致熱。在腹腔內埋植發(fā)射子遙測體溫變化過程，同時應用熒光測定法檢測下丘腦細胞內鈣離子濃度的變化，Western blot方法檢測TRPV1表達水平。結果隨著Capsazepine劑量增大，LPS致大鼠發(fā)熱水平升高，下丘腦細胞內鈣離子濃度減少，TRPV1表達水平降低。結論Capsazepine作用于大鼠下丘腦，可使LPS誘導的發(fā)熱水平提高，此效應可能與TRPV1的作用有關。

關鍵詞：發(fā)熱；瞬時受體電位香草酸受體1；Capsazepine; LPS; 下丘腦；Ca`(2+)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.009

文章編號：

文獻標志碼：A1001-1978(2015)01-0035-04

收稿日期:2014-09-21,修回日期:2014-10-11

基金項目：國家自然科學基金主任基金(No 31340074)；遼寧省自然科學基金(No 201202277)

作者簡介：Bibek Khanal(1986-)，男，碩士，助教，研究方向：體溫生理，E-mail:bibekcmu@163.com

通訊作者曹宇(1963-)，女，博士，教授，研究方向：體溫生理,,E-mail:caoycmu@163.com

Abstract:AimTo observe the effects of the transient receptor potential vanilloid receptor 1(TRPV1) antagonist Capsazepine on the LPS-induced fever process. MethodsThree doses of Capsazepine were respectively injected into rats’ lateral ventricles before the intraperitoneal injection of LPS caused fever. An emitter was implanted inside the rat’s abdominal cavity to monitor the body temperature changes during the fever process. Then the changes of calcium ion in the hypothalamus were detected by fluorescence and the expressions of TRPV1 protein were detected by Western blot. ResultsThe higher dosage of Capsazepine was injected, the higher the level of LPS-induced fever was, and the lower the concentration of calcium ion in the hypothalamus as well as the TRPV1 expressions were. ConclusionCapsazepine could increase the level of fever induced by LPS via acting on the rats’ hypothalamus. This effect might be related to the functions of TRPV1.

發(fā)熱是臨床上常見的體征。一般認為病原體引起的機體發(fā)熱是由于外源性致熱原進入體內，促進單核巨噬細胞釋放內生致熱原，內生致熱原直接或間接作用于體溫調節(jié)中樞，進而使體溫調節(jié)中樞的調定點上移，引起機體出現(xiàn)調節(jié)性體溫升高。臨床和實驗研究表明，哺乳類動物和人在發(fā)熱時體溫很少超過一定水平，例如，人體的體溫升高極少超過41℃，說明體內存在著調控體溫的自限機制，然而，目前其詳細的分子生物學機制還不清楚。機體實現(xiàn)對體溫的調控關鍵的一環(huán)是對溫度的感受性，近年來人們發(fā)現(xiàn)了在多種感受器中存在的一組被稱為瞬時受體電位(transient receptor potential，TRP)的通道蛋白具有傳遞感覺信息的功能，其中，有的成員具有溫度感受特性，在組織細胞中可能起“溫度換能器”的功能[1]，這一發(fā)現(xiàn)極大地推動了對機體溫度感知生物學機制的研究。

瞬時受體電位香草酸受體1 (transient receptor potential vanilloid 1, TRPV1)是TRP家族成員之一，是一種對Ca2+有高滲透性的非選擇性陽離子通道[2]，可被溫熱等多種理化因素激活，例如，大于43℃的熱刺激、辣椒素和質子等[3]，在整體水平發(fā)熱條件下，炎性介質等會降低激活該通道的溫度閾值[4]。TRPV1在哺乳動物組織中表達部位廣泛，現(xiàn)已證明，在下丘腦體溫調解中樞也有TRPV1的表達[5]，然而，關于TRPV1在體溫調節(jié)機制中的作用目前還不清楚，根據(jù)其對高溫刺激的敏感性推測可能與機體發(fā)熱時的限熱機制有關。

Capsazepine是TRPV1通道特異性頡抗劑，被廣泛應用于痛覺傳入機制的研究[6]。本實驗通過采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)復制大鼠發(fā)熱模型，在側腦室內給予不同劑量的capsazepine，觀察發(fā)熱時相的變化、下丘腦TRPV1表達量及細胞內鈣離子濃度變化，為進一步深入探討TRPV1通道在機體發(fā)熱過程中的作用提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組選用清潔級♂SD大鼠，體質量250～280 g，基礎體溫(38.1±0.2)℃，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。飼育室室溫(20±2)℃，相對濕度40%~60%，晝夜光照節(jié)律12 h ∶12 h，單籠飼養(yǎng)，自由進食水。

將實驗動物隨機分成6組，每組6只：① 正常對照組(Control)：側腦室(intracerebroventricular, icv)注射溶劑10μL(溶劑為10%無水乙醇+10% Tween80 + 80%生理鹽水)，30min后腹腔注射(intraperitoneal injection，i.p.)生理鹽水4 mL·kg-1；② Capsazepine組(CPZ)：icv CPZ10 μL(Sigma, USA)，含量為0.02 mg·kg-1，30 min后i.p.生理鹽水4 mL·kg-1；③ LPS致熱組(LPS)：icv溶劑10 μL，30 min后i.p.LPS 80 μg·kg-1(20 mg·L-1，用生理鹽水配制)(Sigma, USA)；④、⑤及⑥組分別icv CPZ 0.01、0.02和0.03 mg·kg-1，均調至為10 μL。30 min后i.p.LPS 4 mL·kg-1。

1.2腦室插管給藥將大鼠用10%水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔麻醉，然后將其頭部固定于立體定位儀上，暴露前囟。參照大鼠腦圖譜，用探針在顱骨表面冠狀縫下0.8 mm，矢狀縫旁開1.5 mm處鉆孔，將外徑為1 mm的引導管垂直插入一側側腦室內，深度4.0 mm，用牙科水泥固定導管，按照上述實驗步驟給藥。

1.3記錄體溫大鼠麻醉后在腹正中線行剖腹術，將無線遙測發(fā)射子固定于腹壁上。術后動物單籠飼養(yǎng)，恢復1周后進行實驗。使用無線BW-200數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)記錄體溫變化。實驗均在早8時開始，首先每隔5 min測量體溫1次，共測量3次，取其平均值記為基礎體溫。然后各組在相應處理后開始監(jiān)測體溫變化，每隔5 min自動記錄體溫一次，直到實驗結束。

體溫反應指數(shù)(therm1 response index，TRI)的測算按照Milton法[7],計算發(fā)熱曲線與體溫基線之間的面積,其中，體溫值為縱坐標，1.5 cm代表0.5℃，以時間值為橫坐標，1.5 cm代表1 h。TRI可以反映發(fā)熱效應的強度。

1.4下丘腦細胞內鈣離子濃度([Ca2+]i)測定實驗結束后迅速分離出下丘腦組織，制備成單細胞懸液，保持細胞存活率在95%以上。然后用Fura-2/AM避光孵育負載，采用日立F-4500型熒光雙波長分光光度計，激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長510 nm，測定熒光值，根據(jù)公式計算[Ca2+]i。[Ca2+]i=Kd×(R-Rmin)/(Rmax-R)×F2min /F2max( nmol·L-1)。Kd值為224 nmol·L-1，R為熒光值，F(xiàn)2 min為加入EGTA 后測得的熒光值，F(xiàn)2max為加入Triton X-100后測得的熒光值，[Ca2+]i 為nmol·L-1。

2結果

2.1各實驗組大鼠體溫的變化Fig 1顯示各組在經(jīng)過不同實驗因素處理后，體溫變化值(ΔT, ℃)隨時間的變化曲線。給予大鼠腹腔注射LPS可引起體溫升高，在4 h左右大鼠體溫達到高峰，之后體溫開始下降；在發(fā)熱期間LPS組在各觀察時間點與Control組比較體溫變化差異均有顯著性(P<0.05)。當預先經(jīng)側腦室注入capsazepine，30 min后腹腔注射LPS后，大鼠體溫也明顯升高，在4h左右體溫達到高峰，與Control組和CPZ組各采樣時間點比較體溫變化值差異有顯著性(P<0.05)；與LPS組相比，0.02 mg·kg-1劑量組和 0.03 mg·kg-1劑量組自2 h以后，發(fā)熱過程中的各時間點ΔT值均升高(P<0.05)，且在4~5.5 h期間，體溫持續(xù)保持在高峰水平。0.01 mg·kg-1劑量在發(fā)熱起始階段略高于LPS組，但各時間點ΔT與LPS組比較無顯著性差異(P>0.05)。在CPZ 3個劑量組中隨著CPZ給藥劑量的增加，發(fā)熱幅度呈相應增加，但在0.02 mg·kg-1劑量組和 0.03 mg·kg-1劑量組之間差異沒有顯著性(P>0.05)。Control組與CPZ組比較各時間點ΔT差異無顯著性(P>0.05)。

Tab 1為各組在實驗過程中體溫變化最大值(ΔTmax)及體溫反應指數(shù)TRI4及TRI7。在預先應用capsazepine的3個劑量組中，體溫變化最大值由高至低的順序為0.03 mg·kg-1劑量組、 0.02 mg·kg-1劑量組和0.01 mg·kg-1劑量組。TRI4及TRI7也呈現(xiàn)相似的變化趨勢。

2.2下丘腦神經(jīng)元[Ca2+]i的變化圖2顯示了不同組下丘腦細胞內[Ca2+]i水平?？梢姡珻ontrol組為(186.1±5.8)nmol·L-1，CPZ組為(178.0±2.4)nmol·L-1，兩組之間差異沒有顯著性。LPS組為(275.2±5.8)nmol·L-1顯著高于Control組和CPZ組，預先給與CPZ，再行LPS誘導發(fā)熱的各實驗組中0.01、0.02和 0.03 mg·kg-1劑量組測定值分別為(249.9±2.6)、(234.5±5.9)和(232.7±7.1)nmol·L-1，與LPS組比較明顯降低(P<0.05)，且表現(xiàn)為CPZ劑量依賴性下降。下丘腦[Ca2+]i的變化與體溫的變化成正相關(r=0.942，P<0.01)Y=133.94+72.07X。

Tab 1Maximum change of temperature and thermal response

GroupΔTmax(℃)TRI4(cm2)TRI7(cm2)Control0.10±0.010.20±0.060.38±0.02LPS1.09±0.11*9.09±0.09*21.33±0.19*CPZ0.11±0.020.35±0.390.63±0.430.01mg·kg-1CPZ+LPS1.11±0.10*10.42±0.15*23.27±0.85*0.02mg·kg-1CPZ+LPS1.37±0.03*#12.07±0.36*#30.63±0.48*#0.03mg·kg-1CPZ+LPS1.42±0.02*#12.54±0.38*#30.65±0.40*#

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsLPS

Fig 2　Concentration of intracellular calcium in hypothalamus

*P<0.05vsLPS group

2.3下丘腦組織TRPV1表達的變化Fig 3 顯示了Western blot方法檢測各實驗組下丘腦組織中TRPV1的表達水平并進行圖像定量分析的結果?？梢?，LPS組在給予LPS后TRPV1表達量明顯高于Control組(P<0.05)，而預先側腦室注入CPZ后再給予LPS，0.01 mg·kg-1組與LPS組的表達水平差異無顯著性，但0.02和0.03 mg·kg-1組的表達水平明顯低于LPS組(P<0.05)。 Control組與CPZ組之間比較無顯著性差異。

3討論

Fig 3Expression of TRPV1 in hypothalamus in

A: Western blot result； B: Comparative analysis of Western blot result.**P<0.01vsgroup LPS

哺乳動物和人的體溫在自主性體溫調節(jié)和行為性體溫調節(jié)下能夠保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)，但在某些生理或病理條件下可出現(xiàn)體溫升高，而過高的體溫不利于機體進行各種正常的功能活動，甚至引起不可逆性損傷。關于機體是如何調控發(fā)熱時體溫上限的，許多學者做了大量的研究，現(xiàn)已證實體內存在一些體溫負調節(jié)物質，例如，精氨酸加壓素(arginine vasopressin, AVP)、促黑素細胞激素(α-melanocyte stimulating hormone, α-MSH)、脂皮質蛋白(lipocortin)、膜聯(lián)蛋白A1(annexin A1)等[8]，但迄今為止，調控這些物質作用的生物學機制仍不清楚。TRP是近年來發(fā)現(xiàn)的主要與多種感受功能有關的膜通道蛋白家族，主要包括TRPC、TRPV、TRPM、TRPML、TRPP、TRPA、TRPN等7個亞族，其中，TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPM2、TRPM4、TRPM5、TRPM8和TRPA1具有溫度感受特性，它們被激活的溫度閾值各不相同。TRPV家族成員之一的TRPV1主要表達于背根神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)的小型及中型神經(jīng)細胞等感覺傳入部位[9，10]，多與傷害性熱痛覺的產(chǎn)生相關聯(lián)。最近有研究報道，在下丘腦體溫調節(jié)中樞有TRPV1的表達。有研究發(fā)現(xiàn)[11]，TRPV1的激活因素之間存在著相互作用，在pH 7.4條件下，熱激活TRPV1的閾值是43℃；在酸性條件時，激活閾值向低溫方向移動。用轉染TRPV1的HEK293細胞實驗證明，當溫度>43℃時， TRPV1通道被激活，而在炎癥介質存在下，TRPV1通道激活的溫度閾值可降低到37℃左右[12]。TRPV1的溫度感受特性提示其在下丘腦體溫調節(jié)中樞很可能參與發(fā)熱過程中的體溫調節(jié)，特別是對限制體溫升高的幅度具有重要的意義。

進一步探討下丘腦TRPV1參與體溫調節(jié)的生物作用，其特異性激動劑或拮抗劑的應用是重要的研究手段。Capsazepine是一種合成的辣椒素的類似物，能特異性阻斷TRPV1通道，被廣泛應用于TRPV1通道的研究中。其抑制鈣離子內流的IC50為0.65 mmol·L-1。生物測定顯示，capsazepine能有效的拮抗TRPV1激動劑辣椒素和樹膠脂毒素(Resiniferatoxin, RTX)的作用，包括鈣離子的內流、培養(yǎng)神經(jīng)元的全細胞電流及辣椒素激活的單通道電流、反射性的去極化和神經(jīng)肽的釋放等[13]。

作為細菌內毒素的LPS是革蘭陰性細菌細胞壁的主要成分，是一種常見的外源性致熱原，它能夠刺激機體產(chǎn)生內生性致熱原，從而使體溫升高。本實驗通過給予大鼠腹腔注射外源性致熱原LPS，復制大鼠發(fā)熱模型，觀察到大鼠腹腔注射LPS后，體溫明顯升高，給予不同劑量的capsazepine后，體溫升高幅度呈現(xiàn)劑量依賴性增加，且在較高濃度時，發(fā)熱高峰持續(xù)時間延長，同時檢測到與之伴隨的細胞內Ca2+濃度降低，提示了TRPV1可能參與發(fā)熱過程的體溫調節(jié)。實驗還觀察到應用capsazepine后，TRPV1表達量減少，說明capsazepine不僅能阻斷TRPV1通道，可能還具有抑制TRPV1表達或抑制TRPV1向細胞膜轉運的作用。以上的實驗結果為深入研究體溫調節(jié)中樞TRPV1的生理功能，明確機體體溫調節(jié)自限現(xiàn)象的生物學機制奠定了基礎，提供了重要的實驗依據(jù)。期待隨著系統(tǒng)的研究，取得對這一生命現(xiàn)象更深刻的認識。

參考文獻：

[1]Mishra S K,Tisel S M, Orestes P, et al. TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation[J].EMBOJ, 2011, 30(3):582-93.

[2]Sokabe T, Tominaga M. Molecular mechanisms underlying thermosensation in mammals[J].BrainNerve, 2009, 61(7):867-73.

[3]Szallasi A, Blumberg P M. Vanilloid (Capsaicin) receptors and mechanisms[J].PharmacolRev, 1999, 51(2): 159-212.

[4]Cortriqht D N, Szallzsi A. Biochemical pharmacology of the vanilloid recepter TRPV1[J].EurJBiochem, 2004,271(10):1814-9.

[5]Trinklein N D, Murray J I, Hartman S J, et al. The role of heat shock transcription factor 1 in the genome-wide regulation of the mammalian heat shock response[J].MolBiolCell, 2004, 15(3):1254-61.

[6]Rohm B, Holik A K, Somoza M M, et al. Nonivamide, a capsaicin analog, increases dopamine and serotonin release in SH-SY5Y cells via aTRPV1-independent pathway[J].MolNutrFoodRes, 2013,57(11):2008-18.

[7]Milton A S, Wendlandt S. Effects on body temperature of prostaglandins of the A, E and F series on injection into the third ventricle of unanaesthetized cats and rabbits[J].JPhysiol, 1971,218(2):325-36.

[8]Roth J. Endogenous antipyretics[J].ChinicaActa,2006, 37 (1): 13-24.

[9]Smith W L, DeWitt D L, Garavito R M. Cyclooxygenases: structural, cellular, and molecular biology[J].AnnuRevBiochem, 2000,69: 145-82.

[10]王勝蘭，戴毅，劉曉麗，等. TRP通道與偏頭痛[J]. 中國藥理學通報，2013，29(10)：1352-4.

[10]Wang S L,Dai Y,Liu X L,et al. TRP channel and migracine[J].ChinPharmacolBull, 2013，29(10)：1352-4.

[11]Nakagawa H, Hiura A. Capsaicin, transient receptor potential(TRP) protein subfamilies and the particular relationship between capsaicin receptors and small primary sensory neurons[J].AnatSciInt, 2006, 81(3): 135-55.

[12]Tominaga M. Molecular mechanisms of thermosensation[J].NipponYakurigakuZasshi, 2004, 124(4): 219-27.

[13]Alexandru B, Bogdan A, Ulrich K, et al. Cooling inhibits capsaicin induced currents in cultured rat dorsal root ganglion neurons[J].NeurosciLett, 2002, 317(6): 131-4.

Capsazepine in rats′ lateral ventricles: Effect of different doses on LPS-induced fever

BIBEK Khanal，SHI Bei, PUJA Paudel, ZHANG Pan, QIN Xin, CAO Yu

(DeptofPhysiology,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China)

Key words: fever; transient receptor potential vanilloid receptor 1; Capsazepine; LPS; hypothalamic; Ca2+