·論著·

用HPLC法同時測定比格犬血漿中地西泮、去甲西泮和氟馬西尼的濃度

李文清，鄒豪，鐘延強*(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，上海 200433)

[摘要]目的：建立測定比格犬血漿中地西泮、去甲西泮和氟馬西尼濃度的HPLC法。方法：采用Kromasil 100-5 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以氯硝西泮為內(nèi)標(biāo)，甲醇(A)-水(B)-四氫呋喃(C)為流動相(55∶40∶5)，流速1.0 ml/min，檢測波長254 nm；柱溫25 ℃。結(jié)果：地西泮、去甲西泮和氟馬西尼在濃度范圍為0.025～1.000 μg/ml時線性良好(r=0.999 9，0.999 0，0.998 9)，日內(nèi)和日間RSD均<6%(n=5)，回收率接近100%。結(jié)論：本方法準(zhǔn)確、快速、簡便，可用于比格犬血漿中地西泮、去甲西泮和氟馬西尼濃度的同時測定。

[關(guān)鍵詞]含量測定；地西泮；去甲西泮；氟馬西尼；色譜法，高效液相

[中圖分類號]R927.2,R971.3[文獻標(biāo)志碼]A

DOI：10.5428/pcar20150212

作者簡介李文清(男)，碩士生.E-mail：lwqlpp@163.com

doi1.2藥品和試劑氯硝西泮對照品、去甲西泮對照品(瑞典Hunge University Hospital臨床藥理室贈送)，地西泮對照品(含量>98%，山東信誼制藥有限公司)，氟馬西尼對照品(含量>98%，湖南華納大藥廠有限公司)，比格犬空白血漿(第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心)；碳酸氫鈉為化學(xué)純，甲醇、磷酸、乙醚、二氯甲烷為色譜純(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；去離子水(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室自制)。

[收稿日期]2015-01-15

Simultaneous determination of diazepam,nordazepam and flumazenil in Beagle dog plasma by HPLC method

ABSTRACT[]Objective：To establish an HPLC method for simultaneous content determination of diazepam,nordazepam and flumazenil in Beagle dog plasma. Methods： The analysis was performed on Kromasil 100-5 C18 column(250 mm×4.6 mm,5 μm).Clonazepam was used as an internal standard.The mobile phase was composed of methanol(A)-water(B)-tetrahydrofuran(C)(55∶40∶5) at a flow rate of 1.0 ml/min.The detection wavelength was 254 nm and the column temperature was 25 ℃.Results: Diazepam,nordazepam and flumazenil were in good linearity within the ranges of 0.025-1.000 μg/ml (r=0.999 9,0.999 0,0.998 9).Intra-day and inter-day RSD were both less than 6%(n=5).Recovery rates were nearly 100%. Conclusion： The HPLC method is accurate,rapid,simple and could be used for simultaneous determination of diazepam,nordazepam and flumazenil in Beagle dog plasma.

[KEY WORDS]content determination;diazepam;nordazepam;flumazenil;chromatography,high performance liquid

[Pharm Care Res，2015，15(2)：126-128]

*通信作者(Corresponding author)：鐘延強，E-mail：yqzhong68@163.com

1儀器和試藥

1.1儀器Column Oven L-2300/Auto Sample L-2200 HPLC儀(日本Hitachi公司)；Kromasil 100-5 C18色譜柱(瑞典Kromasil公司)；ROTANTA 460R離心機(德國Hettich公司)；VORTEX-QILINBEIER6渦旋儀(江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；AL104萬分之一電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

2方法和結(jié)果

2.1色譜條件Kromasil 100-5 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)-水(B)-四氫呋喃(C)=55∶40∶5，用磷酸調(diào)pH=2.2；流速1.0 ml/min；柱溫25 ℃；檢測波長254 nm；進樣量10 μl。

2.2標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液及內(nèi)標(biāo)儲備溶液的配制精密稱取地西泮、去甲西泮、氟馬西尼對照品和氯硝西泮對照品(內(nèi)標(biāo))各10 mg，分別置于100 ml容量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，分別配成100 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，置-4 ℃保存。臨用前再混合，并稀釋至所需濃度。

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布者則采用兩獨立樣本t檢驗，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進行統(tǒng)計描述；不符合正態(tài)分布者則采用秩和檢驗，以中位數(shù)及四分位間距進行統(tǒng)計描述；重復(fù)測量設(shè)計的計量資料比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以例（百分率）表示。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3血樣處理取比格犬血漿0.4 ml，加入標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和內(nèi)標(biāo)儲備溶液各0.04 ml，用碳酸氫鈉飽和溶液0.4 ml堿化，渦旋30 s后加入乙醚∶二氯甲烷(60∶40)的萃取液，渦旋3 min。取上清液揮干，殘渣加100 μl甲醇溶解，進樣10 μl，測定樣品峰面積。

2.4專屬性實驗在此色譜條件下，血漿雜質(zhì)對4種藥物無干擾，且4種藥物色譜峰分離良好(見圖1)。氟馬西尼、氯硝西泮、去甲西泮、地西泮的保留時間分別為4.15、7.61、11.44、13.28 min。

2.5線性關(guān)系考察取空白血漿0.4 ml，精密加入一定量混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液及內(nèi)標(biāo)儲備溶液，配成3種藥品濃度均分別為0.025、0.05、0.10、0.125、0.25、0.50、1.00 μg/ml血漿樣品，并按2.3項下方法處理后進樣。以待測藥品與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(A)對血漿濃度(c)進行線性回歸，求出各種藥品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(見表1)。

圖1　氟馬西尼、去甲西泮、地西泮的HPLC譜圖 Figure 1　HPLC photograms of flumazenil, nordazepam and diazepam A：空白血漿；B：血漿樣品；1：氟馬西尼； 2：內(nèi)標(biāo)氯硝西泮；3：去甲西泮；4：地西泮

表1　3種藥品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.6提取回收率、方法回收率和最低檢測限取空白血漿0.4 ml，準(zhǔn)確加入一定量混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液及內(nèi)標(biāo)儲備溶液，配成低、中、高3種濃度的血漿樣品作為提取回收率實驗用的含藥血漿(3種藥品濃度均為0.05、0.10、0.50 μg/ml)，按2.3項下方法處理，萃取后藥品進樣所得的峰面積與對應(yīng)濃度藥品標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液直接進樣所得峰面積的比值即為提取回收率，具體見表2。

表2　回收率和精密度實驗結(jié)果

取空白血漿0.4 ml，同法配成相同濃度的血漿樣品，按2.3項下方法處理，測定峰面積(A)，代入表1標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計算濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得到的濃度與樣品實際濃度的比值即為方法回收率。每種濃度在1 d內(nèi)平行測5次，連續(xù)測5 d，計算方法回收率及精密度，具體見表2。

以低濃度對照品混入血漿后，測得相應(yīng)藥物的濃度與其響應(yīng)值作為比較，并以信噪比(S/N)=3為臨界值來計算最低檢測限。計算得氟馬西尼的最低檢測限為7 ng/ml，地西泮與去甲西泮的最低檢測限為6 ng/ml。

2.7穩(wěn)定性取空白血漿0.4 ml，同法制備低、中、高濃度血漿樣品并按2.3項下方法處理，分別考察室溫下放置24 h、-20 ℃下放置14 d、反復(fù)凍融3次處理后的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示所有穩(wěn)定性實驗中其RSD均<8%，表明血漿中地西泮、去甲西泮、氟馬西尼在上述3種條件下穩(wěn)定性良好。

3討論

樣品前處理方法直接關(guān)系到檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究對血漿的前處理方法進行了考察，在正常劑量下，地西泮、去甲西泮及氟馬西尼在體內(nèi)的濃度很小，選用液液萃取的方法可以實現(xiàn)血漿中藥品的富集，有助于提高檢測靈敏度。選用乙醚∶二氯甲烷(60∶40)為萃取液，提取效率高且易揮干，在254 nm波長處雜質(zhì)干擾小。

地西泮在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物眾多，其中去甲西泮為有藥理活性的代謝產(chǎn)物之一，對于中國人來說更是唯一與地西泮消除相關(guān)的代謝產(chǎn)物。由于種屬差異，地西泮在比格犬體內(nèi)的半衰期比人短很多[7]，與人相同的是，在比格犬體內(nèi)，去甲西泮也是與地西泮消除相關(guān)的代謝產(chǎn)物。氟馬西尼是一種苯二氮受體拮抗劑，對苯二氮受體具有很強的親合力，可競爭性拮抗苯二氮類藥物與受體結(jié)合，從而減弱該類藥物的藥理作用，廣泛應(yīng)用于臨床。因此，同時監(jiān)測3種藥物的血藥濃度具有重要的臨床意義。

【參考文獻】

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[3]Zhang Yuan,Reviriego J,Lou YaQing，etal.Diazepam metabolism in native Chinese poor and extensive hydroxylators ofS-mephenytoin: interethnic differences in comparison with white subjects[J].Clin Pharmacol Ther,1990,48(5):496-502.

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Mao GuiFu. Simultaneous determination of concentration of benzodiazepines in human plasma by HPLC method[J]. Chin J Clin Pharm,2004,13(6):357-360.In Chinese with English abstract.

[7]Klotz U,Antonin K H,Bieck P R.Pharmacokinetics and plasma binding of diazepam in man,dog,rabbit,guinea pig and rat[J].J Pharmacol Exp Ther,1976,199(1):67-73.

[修回日期]2015-03-06

[本文編輯]陽凌燕