·論著·

雙位點(diǎn)微透析-HPLC聯(lián)用平臺(tái)的構(gòu)建與評(píng)價(jià)

王丹1,劉春生2,呂進(jìn)3,曹淼1,胡晉紅4,石力夫4*

(1.第二炮兵總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100088；2.第二炮兵總醫(yī)院骨科，北京 100088；3.第二炮兵總醫(yī)院核與輻射損傷實(shí)驗(yàn)室，北京 100088；4.第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433)

[摘要]目的：建立微透析-HPLC聯(lián)用技術(shù)平臺(tái)，以便自動(dòng)取樣與自動(dòng)進(jìn)樣同步完成。方法：應(yīng)用10孔自動(dòng)進(jìn)樣閥將微透析取樣與HPLC進(jìn)行連接，以葛根素透析液為模型藥物對(duì)儀器性能進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。在線和離線微透析-HPLC聯(lián)用裝置相關(guān)指標(biāo)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。結(jié)果：在所建立的HPLC色譜條件下葛根素在0.1～100 mg/L線性關(guān)系良好(r=1,n=5)。低、中、高濃度葛根素對(duì)照品溶液日內(nèi)精密度RSD分別為1.53%、0.60%、0.33%(n=5)，日間精密度RSD分別為0.92%、0.52%、0.67%(n=5)；重復(fù)性RSD=1.07%(n=5)。葛根素對(duì)照品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好(RSD=1.05%)；定量限為0.2 mg/L(S/N=10)。建立的微透析-HPLC在線與離線裝置進(jìn)行比較，結(jié)果顯示在線裝置的日內(nèi)、日間精密度和穩(wěn)定性均顯著優(yōu)于離線裝置(P<0.05)。結(jié)論：自行研制的雙位點(diǎn)微透析-HPLC聯(lián)用技術(shù)平臺(tái)設(shè)備簡便實(shí)用，可為藥動(dòng)學(xué)與代謝研究提供新的取樣分析檢測方法。

[關(guān)鍵詞]雙位點(diǎn)微透析；色譜法，高效液相；在線聯(lián)用；葛根素

[中圖分類號(hào)]R917[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI：10.5428/pcar20150211

基金項(xiàng)目國家自然科學(xué)基金(81301662),中國博士后科學(xué)基金(2013M532151)

作者簡介王丹(女)，博士后，主管藥師.

[收稿日期]2014-05-09

Construction and evaluation of the on-line platform of double-site microdialysis combined with HPLC method

WANG Dan1,LIU ChunSheng2,Lü Jin3,CAO Miao1,HU JinHong4,SHI LiFu4*(1.Department of Pharmacy，Second Artillery General Hospital of PLA,Beijing 100088,China；2.Department of Orthopedics,Second Artillery General Hospital of PLA，Beijing 100088,China；3.Laboratory of Nuclear and Radiation Injury,Second Artillery General Hospital of PLA，Beijing 100088,China；4.Department of Pharmacy,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)

ABSTRACT[]Objective：To establish the microdialysis and HPLC(MD-HPLC) on-line platform,in order to achieve synchronization of automatic sampling and feeding.Methods：The 10-pore automatic sampling valve was used to connect microdialysis with HPLC instruments.Puerarin was used as the model drug to verify the MD-HPLC performance.Statistical software SPSS 13.0 was used to compare the related data of on-line instrument with those of the off-line by t-Test.Results：Under the established HPLC detection conditions，puerarin showed good linearity at a level of 0.1-100 mg/L，with a correlation coefficient (r) of 1 (n=5). For the low，median and high concentrations of puerarin，relative standard deviations (RSDs) of the inter-day precision were 1.53%，0.60% and 0.33% (n=5)，while RSDs of the intra-day precision were 0.92%，0.52% and 0.67% (n=5),respectively. RSD of repeatability was 1.07% (n=5). Within the period of 36 hours，puerarin standard solution was stable (RSD=1.05%) and quantification limit was 0.2 mg/L (S/N=10). Results showed that the precision，reproducibility and stability of the on-line instrument were all superior to those of the off-line，when comparisons were made between the two (P<0.05). Conclusion： The self-made double-site MD-HPLC on-line platform was simple and practical，and could provide a new approach for sampling and analysis in the research of pharmacokinetics and drug metabolism.

[KEY WORDS]double-site microdialysis；chromatography,high performance liquid；on-line combination；puerarin

[Pharm Care Res，2015，15(2)：123-125,154]

E-mail：wdyy_618@sina.com

*通信作者(Corresponding author)：石力夫，E-mail：shilifu72227@sohu.com

20世紀(jì)末到21世紀(jì)初，微透析取樣技術(shù)實(shí)現(xiàn)了與色譜分析的在線聯(lián)用，并出現(xiàn)多位點(diǎn)取樣[1-3]。在線聯(lián)用真正實(shí)現(xiàn)了生物體內(nèi)待測組分的實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)分析，對(duì)不穩(wěn)定、易降解檢品尤為適用，也更能真實(shí)反映體內(nèi)內(nèi)源性或外源性生化物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物濃度的瞬間變化過程。

本研究采用適宜材料，自制加工所需接口與管路，擴(kuò)展現(xiàn)有10孔自動(dòng)切換閥和HPLC儀控制軟件的功能,整合軟件與硬件系統(tǒng)，使微透析取樣與HPLC進(jìn)樣在設(shè)定好的時(shí)間內(nèi)在線聯(lián)用，成功建立自制微透析取樣與HPLC分析在線聯(lián)用技術(shù)平臺(tái)(在線微透析-HPLC)，并用模型藥物葛根素對(duì)平臺(tái)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1儀器和試藥

1.1儀器LC-10ADVP HPLC儀(包括SPD-10AVP可變波長紫外檢測器，日本島津公司)；10孔自動(dòng)進(jìn)樣閥(美國VICI公司)；微透析設(shè)備(美國BAS公司)；Hypersil-C18色譜柱(大連依利特分析儀器有限公司)；聚丙烯管(PP管，蘇州天裕塑膠有限公司)；聚醚醚酮管(PEEK管，美國 Upchurch Scientific公司)；彈性熔融石英毛細(xì)管(TSP石英管，美國 Polymicro Technologies公司)；瞬間生物兼容性黏合劑(美國 Cyberbond公司)；AG285型電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2試藥葛根素對(duì)照品(含量99%，批號(hào)110752-200511，中國食品藥品檢定研究院)；磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7．4)；甲醇(色譜純，美國Sigma-Aldrich公司)；水為三蒸水(第二炮兵總醫(yī)院制劑室生產(chǎn))；其他試劑均為分析純。

2方法和結(jié)果

2.1葛根素測定色譜條件Hypersil-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)； 流動(dòng)相：甲醇∶0.1%乙酸水溶液=30∶70；流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：221 nm；進(jìn)樣量：10 μl；靈敏度：0.01 AUFS。

2.2微透析-HPLC聯(lián)用技術(shù)平臺(tái)的連接

2.2.1微透析與10孔自動(dòng)進(jìn)樣閥的連接本裝置主要包括3個(gè)連接口、10孔自動(dòng)進(jìn)樣閥的連接兩大部分。3個(gè)接口的連接是將不同內(nèi)外徑尺寸的PP管、PEEK管、TSP石英管通過瞬間生物兼容性黏合劑固定而成(見圖1)，其中接口1與接口2連接方法相同(見圖2)。調(diào)整灌流液流速，緩慢注入到在線微透析-HPLC設(shè)備中。觀察自制在線微透析-HPLC管路系統(tǒng)有無漏液、出現(xiàn)氣泡等狀況，實(shí)驗(yàn)裝置通暢、密閉、死體積小，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.2.210孔自動(dòng)進(jìn)樣閥與HPLC儀的連接10孔自動(dòng)進(jìn)樣閥由①～⑩共10個(gè)連接孔組成，具體見圖3。通過孔④實(shí)現(xiàn)微透析設(shè)備與10孔自動(dòng)進(jìn)樣閥連接，HPLC流動(dòng)相通過孔①流入，與定量環(huán)中的透析液一起流入HPLC色譜柱中，收集透析液的定量環(huán)漫溢后經(jīng)孔⑥流出，孔②與⑦相連保證10孔自動(dòng)進(jìn)樣閥的密閉性，通過孔⑨實(shí)現(xiàn)10孔自動(dòng)進(jìn)樣閥與HPLC系統(tǒng)連接，孔③與⑩連接定量環(huán)1，孔⑤與⑧連接定量環(huán)2。

圖1　微透析-HPLC在線聯(lián)用連接管路示意圖 Figure 1　Diagram of microdialysis-HPLC on-line platform

圖210孔自動(dòng)進(jìn)樣閥與微透析和
HPLC設(shè)備管路連接接口
Figure 2Pipeline interface of microdialysis and HPLC
through the 10-pore automatic sampling valve
接口1：a和b為聚丙烯管，c為探針進(jìn)樣管；接口3：a為聚丙烯管，
b為彈性熔融石英毛細(xì)管,c為聚醚醚酮管

圖3　10孔自動(dòng)進(jìn)樣閥連接示意圖 Figure 3　Diagram of the 10-pore automatic sampling valve A：血液樣品；B：皮膚樣品

2.3微透析-HPLC技術(shù)平臺(tái)的聯(lián)用10孔自動(dòng)進(jìn)樣閥的VCOM軟件和HPLC工作站的CLASS-VP軟件可同時(shí)在Windows XP系統(tǒng)中開啟，VCOM軟件可發(fā)送一系列既定時(shí)間間隔信號(hào)控制10孔自動(dòng)進(jìn)樣閥的進(jìn)樣時(shí)間、間隔與循環(huán)次數(shù)，其中進(jìn)樣間隔取決于HPLC色譜工作站的出峰時(shí)間，循環(huán)次數(shù)取決于待監(jiān)測藥物的藥動(dòng)學(xué)過程。打開CLASS-VP軟件，對(duì)HPLC色譜條件進(jìn)行設(shè)定、保存，啟動(dòng)HPLC的同時(shí)開啟VCOM軟件界面，使其同步設(shè)定。10孔自動(dòng)進(jìn)樣閥的A(皮膚探針微透析液樣品)和B(血液探針微透析液樣品)兩個(gè)定量環(huán)如此循環(huán)往復(fù)，交替進(jìn)樣，樣品的色譜峰被顯示并保存在HPLC系統(tǒng)中。HPLC色譜工作站對(duì)保存的數(shù)據(jù)進(jìn)行積分，可以獲得葛根素在皮膚、血液中的待測藥物峰面積(見圖4)，從而計(jì)算藥物濃度。

圖4　血液和皮膚微透析液中葛根素的HPLC譜圖 Figure 4　HPLC photograms of puerarin in blood and skin microdialysis fluids 1：血液樣品中葛根素色譜峰；2：皮膚樣品中葛根素 色譜峰；箭頭所指為10孔自動(dòng)進(jìn)樣閥切換時(shí)間

2.4微透析-HPLC在線聯(lián)用技術(shù)儀器性能考察

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液配制精密稱取葛根素對(duì)照品100 mg，置100 ml容量瓶中，加PBS溶液,超聲溶解并定容至刻度，搖勻,制成含1000 mg/L葛根素對(duì)照品儲(chǔ)備液，并以此為母液，用PBS溶液分別配制0.1、1、2、5、10、20、50、100 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

2.4.2線性關(guān)系考察取各濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，分別設(shè)定10孔自動(dòng)進(jìn)樣閥的程序自動(dòng)進(jìn)樣，在2.1項(xiàng)色譜條件下分析測定，以濃度c(mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。在線回歸方程為：A=31 304c+3 825.2 (r=1)，離線回歸方程為：A=29 369c+7 846.8(r=0.999 9)，線性范圍均為0.1～100 mg/L。

2.4.3精密度在2.1項(xiàng)色譜條件下，分別將高、中、低(100、10、0.1 mg/L)濃度的葛根素對(duì)照品溶液置微透析灌注泵中(流速2 μl/min)，設(shè)定10孔自動(dòng)進(jìn)樣閥的程序(進(jìn)樣間隔6 min)，自動(dòng)進(jìn)樣10 μl，每種濃度進(jìn)樣5次，考察日內(nèi)精密度。 結(jié)果峰面積的RSD分別為1.53%、0.60%、0.33%(n=5)。實(shí)驗(yàn)條件同上，每種濃度進(jìn)樣5次，連續(xù)測定3 d，考察日間精密度，結(jié)果峰面積的RSD分別為0.92%、0.52%、0.67%(n=5)。

2.4.4重復(fù)性取濃度為1 mg/L的葛根素對(duì)照品溶液置微透析灌注泵中，同2.4.3項(xiàng)下方法每種濃度進(jìn)樣5次，在2.1項(xiàng)色譜條件下考察重復(fù)性。結(jié)果葛根素對(duì)照品溶液的RSD=1.07%(n=5)，表明重復(fù)性良好。

2.4.5穩(wěn)定性取濃度為5 mg/L的葛根素對(duì)照品溶液分別置微透析灌注泵中(流速2 μl/min)，于0、2、4、6、8、10、12、24、36 h在2.1項(xiàng)色譜條件下，同2.4.3項(xiàng)下方法測定葛根素峰面積，其RSD=1.05%,表明在線微透析-HPLC測定葛根素對(duì)照品在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6定量限分別配制不同濃度的對(duì)照品溶液，自動(dòng)進(jìn)樣10 μl,測得定量限為0.2 mg/L (S/N=10)。

2.5在線與離線微透析-HPLC的比較將所獲得的自制微透析-HPLC在線聯(lián)用平臺(tái)儀器性能各參數(shù)指標(biāo)，與離線聯(lián)用指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比(兩者的HPLC條件相同)，結(jié)果見表1。應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)方法學(xué)各參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，回歸系數(shù)采用方差分析，相關(guān)系數(shù)、精密度SD、重現(xiàn)性SD、穩(wěn)定性SD采用t檢驗(yàn)。結(jié)果表明，相關(guān)系數(shù)、回歸系數(shù)本身及在線與離線的相關(guān)系數(shù)、回歸系數(shù)的差值均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，比較精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，葛根素在線SD小于離線。因此得出結(jié)論，自行研制的在線微透析-HPLC聯(lián)用平臺(tái)，精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性均優(yōu)于離線，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1　微透析-HPLC在線和離線標(biāo)準(zhǔn)差(SD)比較

*P<0.05，與離線狀態(tài)比較

3討論

本研究所采用的10孔自動(dòng)進(jìn)樣閥由一個(gè)10孔注射器和兩個(gè)定量環(huán)組成。定量環(huán)的體積可以根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)、所選擇模型藥物的不同而改變，并且根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的不同，選擇與HPLC系統(tǒng)不同的連接方法。10孔自動(dòng)進(jìn)樣閥將微透析取樣透析液儲(chǔ)存在定量環(huán)中，借助電動(dòng)力將透析液注入到HPLC 色譜

柱中。它能夠依次連續(xù)地裝載樣品，并按照預(yù)先設(shè)計(jì)好的時(shí)間間隔注入到HPLC分析系統(tǒng)中。為確保進(jìn)樣體積與定量環(huán)容積一致，蓄積體積>進(jìn)樣體積(切換時(shí)間×微透析灌注速度)。注入頻率取決于HPLC完全分離樣品并獲得完整色譜峰圖所需要的時(shí)間，在盡可能獲得完整色譜峰的同時(shí)，也要最大限度提高微透析的時(shí)間分辨率，以全面反映藥物在動(dòng)物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)信息。本研究中將切換時(shí)間設(shè)為6 min，微透析灌注速度為2 μl/min，蓄積體積為12 μl，進(jìn)樣體積為10 μl，2 μl自廢液出口自動(dòng)排出。

本研究建立的微透析-HPLC聯(lián)用技術(shù)平臺(tái)可自動(dòng)取樣、進(jìn)樣與分析，無需處理樣品，減少樣品的污染，無需使用樣品收集瓶，減少轉(zhuǎn)移過程損失，能夠連續(xù)長時(shí)間對(duì)待測樣品進(jìn)行測定，能同時(shí)對(duì)2只以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行考察，或?qū)ν粚?shí)驗(yàn)動(dòng)物2個(gè)靶部位進(jìn)行藥物濃度測定，并且可以同時(shí)聯(lián)接兩臺(tái)HPLC儀進(jìn)行工作。本平臺(tái)設(shè)備簡便實(shí)用，也適用于其他分析監(jiān)測儀器，節(jié)約人力、物力，降低研究成本，同時(shí)也為藥動(dòng)學(xué)與代謝研究提供全新的取樣分析檢測方法。

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[修回日期]2015-03-23

[本文編輯]陽凌燕