·論著·

低分子肝素凝膠處方優(yōu)化及對瘙癢模型小鼠的作用

李超，金海蓉，胡晉紅*(第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433)

[摘要]目的：優(yōu)化低分子肝素(low molecular weight heparin，LMWH)凝膠處方，并觀察其對蛋白酶活化受體2(proteinase activated receptor 2，PAR-2)激動劑SLIGRL-NH2引起小鼠瘙癢的作用。方法： 選用L9(34)正交設(shè)計，優(yōu)化LMWH凝膠處方。32只BALB/c小鼠隨機分成對照組、模型組、地塞米松乳膏組和LMWH凝膠組，每組8只。分別在脫毛部位給予空白凝膠、空白凝膠、復(fù)方醋酸地塞米松乳膏和 LMWH凝膠各0.1 g，2次/d×3 d。最后一次給藥后2 h，除對照組小鼠用藥局部皮內(nèi)注射生理鹽水外，其余3組小鼠皮內(nèi)注射PAR-2激動劑SLIGRL-NH2。觀察皮內(nèi)注射后30 min內(nèi)小鼠的搔抓次數(shù)。結(jié)果：最佳處方是LMWH 3%、月桂氮酮5%、卡波姆1.5%。模型組小鼠搔抓次數(shù)比對照組顯著增多(P<0.01)；復(fù)方醋酸地塞米松乳膏組小鼠搔抓次數(shù)比模型組小鼠顯著減少(P<0.05)；LMWH凝膠組小鼠搔抓次數(shù)比模型組和地塞米松乳膠組小鼠均顯著減少(P<0.01)。結(jié)論：LMWH凝膠能減輕PAR-2激動劑SLIGRL-NH2引起的瘙癢，其作用可能優(yōu)于地塞米松乳膏。

[關(guān)鍵詞]低分子肝素凝膠；處方優(yōu)化；透皮吸收；蛋白酶活化受體2；瘙癢

[中圖分類號]R758.3，R944.15[文獻標志碼]A

DOI：10.5428/pcar20150207

基金項目國家自然科學(xué)基金(81173130)

作者簡介李超(男)，碩士生.

[收稿日期]2014-10-20

Formula optimization of low molecular weight heparin gel and its effect on the mouse model of pruritus

LI Chao，JIN HaiRong，HU JinHong*(Department of Pharmacy，Changhai Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)

ABSTRACT[]Objective：To optimize the formula of low molecular weight heparin (LMWH) gel and observe its antipruritic effects in the mouse model of pruritus induced by proteinase activated receptor-2 (PAR-2) agonist，SLIGRL-NH2.Methods： L9(34) orthogonal design was used to optimize the formula of LMWH gel.Thirty-two BALB/c mice were randomly divided into the control，model，compound dexamethasone acetate cream (CDAC) and LMWH gel groups，each consisting of 8 animals.Blank gel，blank gel，CDAC and LMWH gel at a dosage of 0.1 g,twice a day,for 3 successive days were applied directly to the skin sites of removed hair，respectively.Two hours after the last dosing，saline solution was intradermally injected in the nape of the control group，and PAR-2 agonist SLIGRL-NH2 was given by intradermal injection in the nape of the remaining three groups.The scratching behavior was observed 30 min after intradermal injection.Results： The optimal formula was 3% LMWH，5% azone and 1.5% carbomer.Compared with the control group，the times of scratching significantly increased in the model group (P<0.01).The times of scratching decreased in the CDAC group，compared with that of the model group (P<0.05).The times of scratching decreased in the LMWH gel group，as compared with those of the model and CDAC groups (P<0.01).Conclusion：LMWH gel could relieve pruritus induced by SLIGRL-NH2，with its antipruritic effect being superior to that of CDAC.

[KEY WORDS]low molecular weight heparin gel；formula optimization；transdermal absorption；proteinase activated receptor 2；pruritus

[Pharm Care Res，2015，15(2)：107-110]

E-mail：leechao2012@163.com

*通信作者(Corresponding author)：胡晉紅，E-mail：hjhong2016@126.com

特應(yīng)性皮炎是一種慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病，可在任何年齡發(fā)病，主要發(fā)生于兒童，特別是嬰幼兒期，是影響兒童生長發(fā)育和心理健康的常見疾病之一[1，2]。特應(yīng)性皮炎病人的臨床表現(xiàn)主要是劇烈瘙癢，往往夜間加重，瘙癢程度與病情嚴重程度密切相關(guān)。目前特應(yīng)性皮炎的治療仍無特效方法，臨床上主要以皮質(zhì)激素、免疫調(diào)節(jié)劑和局部紫外線照射治療為主，但由于其嚴重不良反應(yīng)無法長期應(yīng)用，治療間斷后，瘙癢迅速復(fù)發(fā)。因此，特應(yīng)性皮炎瘙癢的治療成為亟待解決的問題。

研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶活化受體2(proteinase activated receptor-2，PAR-2)在病理生理方面與瘙癢相關(guān)[3]。對PAR-2瘙癢信號傳導(dǎo)機制的初步研究發(fā)現(xiàn)，60%的背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia，DRG)表達功能性PAR-2；激活PAR-2引起40%～50%DRG產(chǎn)生Ca2+內(nèi)流；選擇性PAR-2激動劑促進DRG釋放神經(jīng)肽，證明這是PAR-2參與瘙癢反應(yīng)的重要神經(jīng)源性機制[4]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，低分子肝素(low molecular weight heparin，LMWH)在細胞水平可以阻滯PAR-2活化引起的Ca2+內(nèi)流[5]。由此，作者提出這樣一個假設(shè)：LMWH是否可以抑制PAR-2活化誘導(dǎo)的瘙癢？本研究通過正交試驗設(shè)計篩選出最佳LMWH凝膠處方，利用PAR-2激動劑H-Ser-Leu-Ile-Gly-Arg-Leu-NH2(SLIGRL-NH2)構(gòu)建小鼠瘙癢模型[6]，通過行為學(xué)驗證LMWH凝膠透皮給藥的止癢作用，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料

1.1儀器UV-2201紫外分光光度儀(日本島津制作所)；Franz離體透皮擴散儀(第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院自制)；HDR-XR550E型高清攝像機(日本索尼公司)；觀察鼠盒 (規(guī)格：4格，25 cm×18 cm×30 cm)。

1.2藥品和試劑LMWH標準品(批號 LD00CY74，歐洲藥品質(zhì)量管理局)；LMWH原料藥(批號 CE130401，河北常山生化藥業(yè)股份有限公司)；卡波姆940(carbomer，北京市海淀會友精細化工廠)；無水乙醇(常熟市楊園化工有限公司)；月桂氮酮、三乙醇胺、天青Ⅱ(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；復(fù)方醋酸地塞米松乳膏(批號 1403033H，華潤三九醫(yī)藥股份有限公司)；SLIGRL-NH2(純度≥97%，批號 113M4766V，美國Sigma公司)； 生理鹽水 (浙江天瑞藥業(yè)有限公司)； 薇婷脫毛膏 (利潔時公司)。

1.3實驗動物32只成年BALB/c小鼠，體質(zhì)量(20±2) g，雌雄各半；8周齡雄性BALB/cASlac裸鼠，均購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2012-0002。

2方法

2.1LMWH凝膠處方優(yōu)化實驗

2.1.1LMWH含量測定用天青Ⅱ比色法[7，8]檢測溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中的LMWH含量，不同濃度的LMWH標準溶液(LMWH標準品溶于PBS中)100 μl與900 μl天青Ⅱ溶液(0.01 mg/ml)混合，在530 nm波長處有最大吸光度，用紫外分光光度儀檢測吸光度。LMWH在5～30 μg/ml濃度范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系。以吸光度(Y)為縱坐標，濃度(X)為橫坐標進行線性回歸，得標準曲線方程Y=0.001 9X+0.003 9(r=0.999 0,n=3)。

2.1.2LMWH凝膠制備方法稱取卡波姆940，加少量水在室溫下溶脹過夜，滴加三乙醇胺至pH值6～8使成凝膠；稱取LMWH，及溶于1.5 ml無水乙醇的月桂氮酮，分別倒入上述凝膠中，加水至10 g，攪拌均勻備用。

2.1.3LMWH凝膠體外經(jīng)皮滲透動力學(xué)實驗頸椎脫臼處死裸鼠，取其背部皮膚，刮去皮下脂肪，以生理鹽水沖洗干凈，置于生理鹽水中，存放于-20 ℃冰箱內(nèi)備用(一周內(nèi)用畢)。使用Franz擴散池，將離體小鼠皮膚固定在釋放池的下口，角質(zhì)層面向釋放池，釋放面積為1.13 cm2，接收池容積為4 ml。稱取LMWH凝膠0.3 g置釋放池內(nèi)皮膚上，使均勻分布，接受池中加入PBS 4 ml，恒溫(37±0.5) ℃，電磁攪拌器定速攪拌。于1、2、4、6、8、12 h分別取接受液1 ml，同時向接受池中補充等量PBS溶液。以天青Ⅱ比色法測定所取接受液的LMWH含量，用以下公式計算單位面積的累積滲透量Qn。

式中V0為接受液總體積；V為取樣量；qn為第n次實測的滲透量；qi為第n次前每次測得的滲透量。

2.1.4正交試驗設(shè)計與驗證實驗根據(jù)文獻[9,10]，選取三個因素即卡波姆(A)、月桂氮酮(B)、LMWH(C)，每個因素取3個水平(不同劑量，見表1)。采用L9(34)正交表進行LMWH凝膠處方篩選。每個處方進行3次體外經(jīng)皮滲透動力學(xué)實驗，以累積滲透量對時間作圖，所得曲線的直線部分進行回歸，得到累積滲透量-時間回歸方程Q=bt+a(式中Q為累積滲透量，t為時間，b為斜率，a為截距)。分別計算12 h累積滲透量，然后算出每個處方3次實驗的平均數(shù)，從中得到最佳處方中三個因素的配比。

表1　因素水平表

制備實驗所得最佳處方，重復(fù)3次體外經(jīng)皮滲透動力學(xué)實驗，按上述方法得到最佳處方的累積滲透量-時間回歸方程，分別計算出LMWH凝膠12 h累積滲透量，再計算其平均數(shù)。

2.2LMWH凝膠對瘙癢模型小鼠的作用

2.2.1瘙癢模型制備與分組、給藥用PAR-2特異性激動劑SLIGRL-NH2制作瘙癢模型。32只BALB/c小鼠飼養(yǎng)一周以適應(yīng)環(huán)境，實驗前24 h用脫毛膏在小鼠頸背部脫毛，脫毛面積為1.5 cm×2.0 cm。用隨機數(shù)字表將小鼠隨機分成4組，每組8只，為對照組、模型組、復(fù)方醋酸地塞米松乳膏(CDAC)組和LMWH凝膠組，分別在脫毛部位給予空白凝膠、空白凝膠、CDAC和 LMWH凝膠各0.1 g，2次/d，共3 d。最后一次給藥后將小鼠移至觀察盒內(nèi)適應(yīng)環(huán)境2 h，然后迅速于小鼠頸背部皮內(nèi)注射藥物，對照組小鼠注射50 μl生理鹽水，其余3組小鼠均注射50 μl含77.1 μg SLIGRL-NH2的生理鹽水，置于觀察盒進行攝像，記錄小鼠搔抓行為，拍攝時間為30 min。

2.2.2瘙癢行為學(xué)分析根據(jù)雙盲原則，由不清楚具體實驗分組的實驗人員觀看錄像，并記錄小鼠搔抓頸背部脫毛部位的次數(shù)，然后進行統(tǒng)計分析。1次搔抓是指小鼠后爪對頸背部注射部位的1次或連續(xù)多次搔抓，后爪落地代表本次搔抓動作結(jié)束；前肢的活動以及后爪對身體其他部位的搔抓則不作統(tǒng)計。

3結(jié)果

3.1LMWH凝膠體外經(jīng)皮滲透動力學(xué)實驗結(jié)果

3.1.1正交試驗設(shè)計與結(jié)果按正交試驗設(shè)計9個處方，見表2。

每個處方得到 3 個累積滲透量-時間回歸方程Q=bt+a，分別計算12 h累積滲透量，然后算出每個處方的12 h累積滲透量的平均數(shù)，見表2。

表2　正交設(shè)計試驗結(jié)果

注：K1、K2、K3分別表示該列因素在水平數(shù)為1、2、3時12 h累積滲透量的合計數(shù)；R值是用于比較三個因素對透皮吸收速率的影響，R值越大，影響越大

根據(jù)表2可知，LMWH對凝膠透皮速率影響最大，其次是月桂氮酮，最后是卡波姆。由實驗數(shù)據(jù)確定最佳處方配比為LMWH 3%、月桂氮酮5%、卡波姆1.5%。

3.1.2驗證實驗結(jié)果3次離體透皮試驗的12 h累積滲透量分別為147.32、141.00、138.37 μg，12 h累積滲透量平均為(142.23±4.60) μg。

3.2LMWH凝膠對瘙癢模型小鼠搔抓行為的影響對照組、模型組、CDAC組和LMWH凝膠組小鼠在30 min內(nèi)搔抓次數(shù)見表3。結(jié)果表明，模型組小鼠搔抓次數(shù)較對照組小鼠顯著增加說明造模成功，此作用在皮內(nèi)注射后0～5 min開始，一直持續(xù)到10～15 min(P<0.05)。與模型組比較，CDAC組和LMWH凝膠組小鼠在30 min內(nèi)搔抓次數(shù)顯著減少(P<0.05，P<0.01)，此作用在皮內(nèi)注射后5～10 min開始，一直持續(xù)到10～15 min (P<0.05)。與CDAC組比較，LMWH凝膠組小鼠在30 min內(nèi)搔抓次數(shù)顯著減少(P<0.01)，此作用在皮內(nèi)注射后5～10 min開始，一直持續(xù)到15～20 min (P<0.05)。說明LMWH凝膠與CDAC一樣可以對抗SLIGRL-NH2引起的瘙癢，其作用較CDAC強。

(P<0.01)，

表3低分子肝素凝膠對小鼠皮內(nèi)注射SLIGRL-NH2后不同時間搔抓次數(shù)的影響

Table 3Effects of skin topical application of low molecular weight heparin gel on the times of scratching

at different time points after intradermal injection of SLIGRL-NH2in mice

組別皮內(nèi)注射后時間(t/min)0～55～1010～1515～2020～2525～300～30 對照組0.88±2.104.88±7.124.75±8.297.25±10.046.75±10.434.63±8.4829.13±27.46 模型組23.75±22.24*52.50±22.34*51.00±30.78*13.13±16.5712.88±12.829.75±11.18163.00±69.09**復(fù)方醋酸地塞 米松乳膏組17.50±15.2932.25±17.09△27.88±14.70△19.75±7.329.13±11.087.88±13.92114.38±46.64△低分子肝素 凝膠組15.13±17.5912.88±14.21△▲7.63±12.16△▲4.13±7.64▲5.63±7.012.88±4.9448.25±34.40△△▲▲

*P<0.05，**P<0.01，與對照組比較；△P<0.05，△△P<0.01，與模型組比較；▲P<0.05，▲▲P<0.01，與復(fù)方醋酸地塞米松乳膏組比較

4討論

LMWH-Na是由肝素分級或降解而得的較母體分子量更小的組分或片段的鈉鹽，是分子量為3～8 ku(平均為5 ku)的高分子黏多糖類物質(zhì)，親水性強且?guī)в胸撾姾?，難以透過皮膚。月桂氮酮使皮膚角質(zhì)層與脂質(zhì)相互作用，增加皮膚脂質(zhì)的流動性，從而改變皮膚角質(zhì)層的通透性，降低藥物的擴散阻力，特別是對水溶性化合物具有良好的促透效應(yīng)。本研究體外經(jīng)皮滲透實驗結(jié)果顯示，月桂氮酮可顯著提高LMWH的透皮效應(yīng)。

本研究中正交試驗優(yōu)化處方結(jié)果中，篩選的最佳處方的12 h平均累積滲透量與初始9個處方相比最高，所以藥效實驗中選擇最佳處方配比制備LMWH凝膠。

本研究采用皮內(nèi)注射SLIGRL-NH2構(gòu)建非組胺依賴性瘙癢模型[6]，文獻中注射藥物后5 min產(chǎn)生的搔抓次數(shù)最多，20 min后恢復(fù)到用藥前水平，而在本研究中注射藥物后5～10 min內(nèi)產(chǎn)生的搔抓次數(shù)最多，并且在15 min后無明顯搔抓行為，這可能與動物的品系不同或與皮內(nèi)注射劑量不同有關(guān)。文獻中實驗小鼠為CD-1小鼠，本研究使用的是BALB/c小鼠；文獻中皮內(nèi)注射劑量為50 μg的SLIGRL-NH2，本實驗皮內(nèi)注射劑量為77.1 μg。小鼠品種不同，對SLIGRL-NH2的敏感性和反應(yīng)性可能不同，但是本研究與文獻中小鼠產(chǎn)生瘙癢的總體趨勢相似。

本研究結(jié)果顯示，LMWH凝膠可以明顯抑制小鼠體內(nèi)PAR-2活化引起的瘙癢，可能是通過抑制Ca2+內(nèi)流，阻斷了PAR-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而終止瘙癢。結(jié)果可見，LMWH凝膠抗瘙癢作用優(yōu)于CDAC組(P<0.01)，可能是本實驗采用的是注射PAR-2激動劑SLIGRL-NH2致瘙癢模型，LMWH通過阻斷PAR-2信號通路產(chǎn)生的抗瘙癢作用比CDAC更具有針對性。

LMWH在臨床上一直是作為抗凝藥物使用，所以本課題后續(xù)研究將評估LMWH凝膠經(jīng)皮給藥對動物凝血功能的影響，進而通過調(diào)整藥物規(guī)格劑量，爭取在LMWH凝膠治療瘙癢作用和抗凝血作用之間取得平衡。

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[修回日期]2015-03-03

[本文編輯]貢沁燕