·論著·

海洋微生物代謝產(chǎn)物FGFC1的纖溶促進(jìn)作用

傅詩(shī)情1，嚴(yán)婷1，吳文惠2，朱全剛3，郭銳華1,陳山喬1，包斌1*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院海洋藥物教研室，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院海洋藥物與健康食品研究所，上海 201306;3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，上海 200437)

[摘要]目的：研究海洋微生物產(chǎn)生的吡喃并異吲哚酮化合物FGFC1體外和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)促纖溶作用。方法：采用異硫氰酸熒光素(FITC)-纖維蛋白降解法和急性肺血栓大鼠模型法研究FGFC1體外和體內(nèi)的纖溶促進(jìn)作用。結(jié)果：在體外FITC-纖維蛋白降解實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)GFC1在0.5～25 μmol/L濃度范圍內(nèi)，其纖溶促進(jìn)作用隨著濃度升高逐漸增強(qiáng)；當(dāng)FGFC1濃度≥25 μmol/L時(shí)，其纖溶促進(jìn)作用維持在最高水平，EC50為5 μmol/L。在大鼠急性肺血栓實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)GFC1的劑量為5或10 mg/kg能溶解肺血栓，達(dá)到與5 nmol/L劑量單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑相當(dāng)?shù)娜芩ㄐЧ?。結(jié)論：溶栓藥物先導(dǎo)化合物FGFC1具有優(yōu)良的纖溶促進(jìn)作用和溶栓效果。

[關(guān)鍵詞]FGFC1;纖溶活性化合物；纖溶作用；纖維蛋白(原)；溶栓作用

[中圖分類號(hào)]R931.77，R973.2[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI：10.5428/pcar20150205

基金項(xiàng)目國(guó)家863項(xiàng)目(2011AA09070109)，國(guó)家自然科學(xué)基金(81341082)

作者簡(jiǎn)介傅詩(shī)情(女)，碩士生.

[收稿日期]2014-03-12

Fibrinolysis promoting activity of a novel metabolic product of marine microbe-FGFC1

FU ShiQing1,YAN Ting1，WU WenHui2,ZHU QuanGang3,GUO RuiHua1,CHEN ShanQiao1,BAO Bin1*(1.Department of Marine Materia Medica，College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306,China；2.Institute of Marine Drugs and Healthy Food,College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University，Shanghai 201306,China;3.Department of Pharmacy，Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200437,China)

ABSTRACT[]Objective：To study in vitro and in vivo the fibrinolysis promoting activity (FPA) of FGFC1，a pyrylium isoindolinone compound of marine microbial origin. Methods：Fluorescein isothiocyanate (FITC)-fibrin degradation and acute pulmonary embolism model of rats were used in vitro and in vivo to study the FPA of FGFC1. Results：In the in vitro FITC-fibrin degradation experiment，F(xiàn)PA of FGFC1 within the levels of 0.5-25 μmol/L increased with the increase of FGFC1. When the level of FGFC1 was ≥25 μmol/L，F(xiàn)PA was maintained at its peak level and the EC50 was 5 μmol/L. In acute pulmonary embolism model of rats，F(xiàn)GFC1 showed thrombolysis activity with an injection dose of 5 mg/kg and 10 mg/kg. The thrombolysis effect of FGFC1 reached pro-urokinase-type plasminogen activator of 5 nmol/L. Conclusion：FGFC1 showed excellent fibrinolysis promotion and thrombolysis effects as a candidate lead compound of thrombolytic agents.

[KEY WORDS]FGFC1；fibrinolytic compound；fibrinolytic effect；fibrin (ogen)；thrombolytic effect

[Pharm Care Res，2015，15(2)：99-102]

*通信作者(Corresponding author)：包斌,E-mail:bbao@shou.edu.cn

溶栓藥物如單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑(pro-uPA)、重組組織型纖溶酶原激活劑變異體等在消除血栓癥的同時(shí)，也會(huì)帶來(lái)高纖溶狀態(tài)而導(dǎo)致出血危險(xiǎn)。具有新型溶栓機(jī)制的小分子化合物，因具有高效溶栓且出血危險(xiǎn)性小的特點(diǎn)，在血栓疾病治療領(lǐng)域受到研究者的特別關(guān)注[1]。從海洋微生物長(zhǎng)孢葡萄穗霉菌FG216(StachybotryslongisporaFG216，CCTCC M 2012272)中分離的吡喃并異吲哚酮化合物Fungi fibrinolytic compound 1(FGFC1)能促進(jìn)pro-uPA和纖溶酶原的相互活化作用[2]。在此基礎(chǔ)上，作者通過(guò)體外和大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)FGFC1的纖溶促進(jìn)作用。

1材料

1.1藥品和試劑溶栓藥物先導(dǎo)化合物FGFC1為海洋微生物長(zhǎng)孢葡萄穗霉菌FG216的代謝產(chǎn)物，F(xiàn)GFC1的化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。中文化學(xué)名為2,5-雙[2-(4，8-二甲基-3，7-二烯壬基)-3，5-二羥基-2-甲基-2，3，4，7，8，9-六氫-7-氧代-吡喃[2，3-e]并-8-異吲哚基]-戊酸，英文名為2，5-bis-[2-(4，8-dimethyl-nona-3,7-dienyl)-3,5-dihydroxy-2-methyl-2,3,4,7,8,9-hexahydro-7-oxo-pyrano[2,3-e]isoindol-8-yl]-pentanoic acid。FGFC1是作者采用鹽效應(yīng)法[3]分離自海洋微生物長(zhǎng)孢葡萄穗霉菌FG216的培養(yǎng)液。纖維蛋白原、凝血酶、纖溶酶(美國(guó)Sigma公司)；pro-uPA(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈(zèng))；氯吡格雷硫酸鹽、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC) 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。Olympus ix71光學(xué)和熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

圖1　FGFC1的化學(xué)結(jié)構(gòu) Figure 1　The chemical structure of the Fungi fibrinolytic compound 1(FGFC1)

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)菌級(jí)雌性Wistar大鼠42只，體重180～220 g，購(gòu)自上海西普爾-必凱動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)201205213]。在相對(duì)濕度50%～60%、溫度25 ℃的環(huán)境喂養(yǎng)，自然晝夜，自由進(jìn)食和飲水。

2方法和結(jié)果

2.1FITC標(biāo)記纖維蛋白原的方法FITC標(biāo)記纖維蛋白原方法參照文獻(xiàn)[4]。 稱取 0.4 g 纖維蛋白原溶解于40 ml的Na2CO3-NaHCO3緩沖液(50 mmol/L, pH 8.5)，在4 ℃避光環(huán)境中反應(yīng)12 h。反應(yīng)完畢后，使用0.15 mmol/L羥胺終止FITC與纖維蛋白原的結(jié)合反應(yīng)，采用Na2CO3-NaHCO3緩沖液透析除去游離的FITC分子。透析完畢后，將20 ml FITC-纖維蛋白原保存于-80 ℃冰箱，隨后向剩下的20 ml FITC-纖維蛋白原溶液中添加0.1 ml含0.1% CaCl2的凝血酶(10 IU/ml)，室溫下反應(yīng)2 h，使FITC-纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成網(wǎng)絡(luò)狀的FITC-纖維蛋白，7.5×103×g離心 10 min。取沉淀部分，破碎成<5 μm的顆粒分散于20 ml生理鹽水，置于-80 ℃保存。

將10 ng和5 ng FITC-纖維蛋白添加到纖溶酶和pro-uPA反應(yīng)體系中，于37 ℃遮光條件下反應(yīng)1 h，7.5×103×g離心10 min。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳和熒光成像儀檢測(cè)FITC-纖維蛋白的降解產(chǎn)物。纖維蛋白原被FITC標(biāo)記后，經(jīng)凝血酶轉(zhuǎn)變成網(wǎng)絡(luò)狀FITC-纖維蛋白，再在纖溶酶作用下水解成纖維蛋白降解產(chǎn)物(fibrin degradation products，F(xiàn)DP)(見(jiàn)圖2)。圖2顯示,FITC-纖維蛋白降解產(chǎn)物的片段1、片段2、片段3、片段4與FDP的X-寡聚體(X-oligomer)、D-二聚體、中間片段、片段E在分子量上相近[5]。結(jié)果表明纖維蛋白(原)被FITC標(biāo)記。

圖2　FITC-纖維蛋白降解產(chǎn)物的聚丙烯 酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖 Figure 2　Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) photograms of degradation products of FITC-fibrin A：10 ng FITC-FDP；B：5 ng FITC-FDP； FITC：異硫氰酸螢光素；FDP：纖維蛋白降解產(chǎn)物

2.2體外纖溶作用實(shí)驗(yàn)將100 μl含有FITC-纖維蛋白原的Na2CO3-NaHCO3緩沖液分別注入96 孔平底平板孔中，在37 ℃下保溫24 h 至干燥。向干燥的穴孔里添加75 μl含凝血酶的磷酸鹽緩沖液(PBS)(凝血酶濃度為0.68 IU/ml，PBS濃度為20 mmol/L，含150 mmol/L NaCl，pH 7.4)，在37 ℃下維持3 h后，用含有0.1%吐溫80的PBS和不含有0.1% 吐溫80 的PBS 分別沖洗2次和1次，隨后添加含50 μg/ml膠原蛋白的PBS 溶液200 μl，在37 ℃下保溫1 h。棄除緩沖液后用于體外纖溶活性的測(cè)定。將含有10% 血漿的TBS/BSA溶液(即50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液含100 mmol/L NaCl和10% 牛血清白蛋白溶液)100 μl被順次添加到穴孔里，隨后每個(gè)孔分別添加pro-uPA(50 nmol/L)、氯吡格雷硫酸鹽(5 μmol/L)和FGFC1(0.5、 5、10、12.5、25、50 μmol/L)各100 μl，每個(gè)樣品重復(fù)10 次，在37 ℃下保溫1 h，使用熒光分光光度計(jì)在494 nm和520 nm測(cè)定熒光強(qiáng)度，以評(píng)價(jià)FGFC1對(duì)于FITC-纖維蛋白的分解量。結(jié)果見(jiàn)圖3和表1。

4、強(qiáng)化全社會(huì)的環(huán)境保護(hù)意識(shí)和林業(yè)資源保護(hù)意識(shí)。林業(yè)資源的破壞引發(fā)了一系列的生態(tài)環(huán)境問(wèn)題，比如，水土流失、土地沙漠化等，相關(guān)政府部門應(yīng)加強(qiáng)林業(yè)資源保護(hù)工作的宣傳力度，鼓勵(lì)綠色經(jīng)濟(jì)和集約型經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展。加強(qiáng)與其他國(guó)家地區(qū)關(guān)于林業(yè)資源保護(hù)領(lǐng)域的研究合作，學(xué)習(xí)借鑒其他國(guó)家地區(qū)在林業(yè)資源管理方面取得的成功經(jīng)驗(yàn)，不斷的調(diào)整和完善我國(guó)林業(yè)資源發(fā)展機(jī)制。

圖3　FGFC1體外纖溶活性 Figure 3　Fibrinolytic effect of FGFC1 in vitro

圖3顯示，在體外纖溶體系中，隨著FGFC1濃度從0.5 μmol/L增加到50 μmol/L，纖維蛋白降解的數(shù)量迅速增加并達(dá)到最大值，依據(jù)作圖法得到的EC50為7 μmol/L。

表1　FGFC1處理組和對(duì)照組的熒光相對(duì)強(qiáng)度

**P<0.01，與生理鹽水對(duì)照組比較；pro-uPA:單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑

表1顯示，與生理鹽水對(duì)照組比較，50 nmol/L pro-uPA陽(yáng)性對(duì)照組反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度顯示出極顯著差異(P<0.01)。氯吡格雷硫酸鹽在濃度為5 μmol/L時(shí)，與生理鹽水對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異。FGFC1在濃度為0.5～50.0 μmol/L時(shí)，與生理鹽水對(duì)照組相比較具有顯著差異(P<0.01)，EC50為5 μmol/L。體外纖溶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)GFC1具有降解纖維蛋白的作用。

2.3體內(nèi)纖溶作用

2.3.1體內(nèi)纖溶作用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用完全隨機(jī)方法將42只雌性Wistar大鼠分為生理鹽水對(duì)照組，模型組，低、中、高劑量FGFC1處理組，氯吡格雷硫酸鹽陽(yáng)性對(duì)照組和pro-uPA陽(yáng)性對(duì)照組，每組6只。處理前12 h大鼠禁食和禁水。模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和FGFC1處理組的大鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉后，分別從尾靜脈注射10 mg/kg FITC-纖維蛋白，4 h后形成大鼠肺栓塞模型。模型構(gòu)建后，生理鹽水對(duì)照組和模型組大鼠尾靜脈注射給予0.85%生理鹽水1 ml/kg；陽(yáng)性對(duì)照組尾靜脈注射氯吡格雷硫酸鹽5 mg/kg或pro-uPA 2.7 mg/kg；低、中、高劑量FGFC1處理組尾靜脈分別注射2.5、5.0 和10.0 mg/kg的FGFC1。

2.3.2體內(nèi)纖溶作用檢驗(yàn)FGFC1的體內(nèi)纖溶藥效用肺組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)。給藥12 h后，麻醉并脫頸椎處死大鼠，開(kāi)胸取肺。按常規(guī)組織形態(tài)學(xué)操作流程制備大鼠肺組織切片，切片制作過(guò)程中盡量避光，封片的肺組織在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察[5]，其組織形態(tài)學(xué)見(jiàn)圖4。圖4顯示對(duì)照組(4A)肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁厚薄均勻，毛細(xì)血管和細(xì)小支氣管結(jié)構(gòu)清晰而完整。模型組(4B)肺泡壁增厚，血栓形成，毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張并伴少量局灶性出血。從熒光顯微鏡觀察到FITC-纖維蛋白誘導(dǎo)形成的血栓斑塊聚集在肺毛細(xì)血管。肺組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明大鼠肺血栓模型形成。

生理鹽水對(duì)照組、FGFC1處理組和陽(yáng)性對(duì)照組給藥24 h后，觀察各組肺血栓溶解狀況(見(jiàn)圖4)。圖4C顯示，處理24 h后模型組肺組織毛細(xì)血管內(nèi)有熒光物質(zhì)存在(白色箭頭所示)，血栓附近的肺泡壁增厚，血栓沒(méi)有被溶解。圖4D顯示，添加50 nmol/Lpro-uPA后，肺組織內(nèi)沒(méi)有熒光斑塊存在；與圖4C相比，肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁均勻，殘存著肺血栓溶解后的痕跡(白色箭頭)。2.5 mg/kg FGFC1處理組的肺組織切片仍然有明顯血栓(圖片未顯示)，5、10 mg/kg FGFC1處理組見(jiàn)圖4E和4F，肺組織基本沒(méi)有熒光斑塊或熒光點(diǎn)存在，肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，肺泡壁基本均勻，還能清晰觀察到殘存著肺血栓溶解后的痕跡(白色箭頭)。從尾靜脈給予5 mg/kg FGFC1能使肺血栓溶解，10 mg/kg以上劑量的FGFC1能使大鼠肺血栓徹底溶解。

3討論

本研究從體外和大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩個(gè)方面研究了FGFC1的促進(jìn)纖溶作用，基于纖溶酶原和pro-uPA的相互活化促進(jìn)作用構(gòu)筑的體外纖溶實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)GFC1的EC50是5 μmol/L。

由于氯吡格雷硫酸鹽被用于冠狀動(dòng)脈疾病和周圍性血管疾病相關(guān)的抗凝治療[6]， pro-uPA 在生理環(huán)境中可將纖溶酶原轉(zhuǎn)變成纖溶酶來(lái)實(shí)現(xiàn)血栓溶解[7]。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，以溶栓藥物pro-uPA作為陽(yáng)性對(duì)照，并參考抗血小板藥物氯吡格雷的溶栓藥效。體外實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，F(xiàn)GFC1的劑量為5 μmol/L，與50 nmol/L pro-uPA的纖溶作用相似。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)GFC1劑量為5 mg/kg (相當(dāng)于5.76 μmol/L)時(shí)，與2.7 mg/kg pro-uPA的纖溶作用相似，抗血栓藥物氯吡格雷沒(méi)有顯示出類似的纖溶作用。利用FITC標(biāo)記纖維蛋白原是因?yàn)镕ITC-纖維蛋白能作為模板提供熒光信號(hào)，以便于連續(xù)監(jiān)測(cè)纖維蛋白溶解情況[8]。在體外實(shí)驗(yàn)中，隨著FGFC1濃度的增加熒光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)，表明FITC-纖維蛋白被降解，F(xiàn)GFC1在5～50 μmol/L表現(xiàn)出特異性的纖溶活性。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)GFC1與pro-uPA具有相同的溶栓效果。

圖4　各組大鼠肺組織切片圖 Figure 4　The lung tissue slice photograms of rats in each group A:生理鹽水對(duì)照組(光學(xué)顯微鏡下)；B：模型組(光學(xué)顯微鏡下)；C：模型組(熒光顯微鏡下)； D:pro-uPA陽(yáng)性對(duì)照組(2.7 mg/kg)；E、F:分別為5和10 mg/kg FGFC1處理組

【參考文獻(xiàn)】

[1]Thomas G R,Thibodeaux H,Errett C J,etal. Limiting systemic plasminogenolysis reduces the bleeding potential for tissue-type plasminogen activators but not for streptokinase[J]. Thromb Haemost，1996,75(6):915-920.

[2]張艷，吳文惠，周培根,等. 海洋微生物來(lái)源纖溶活性化合物的篩選及其分離[J]. 中國(guó)海洋藥物,2008,27(6):39-43.

Zhang Yan,Wu WenHui，Zhou PeiGen,etal. Screening and isolation of fibrinolytic active compound from marine microorganism[J]. Chin J Mar Drugs，2008,27(6):39-43.In Chinese with English abstract.

[3]張啟,包斌,倪玲,等. 鹽效應(yīng)分離纖溶活性化合物FGFC1[J]. 中國(guó)生化藥物雜志,2012,33(5):515-518.

Zhang Qi,Bao Bin,Ni Ling,etal. Isolation of fibrinolytic compound FGFC1 by salt effect[J]. Chin J Biochem Pharm,2012,33(5):515-518. In Chinese with English abstract.

[4]Murciano J C，Harshaw D，Neschis D G,etal. Platelets inhibit the lysis of pulmonary microemboli[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2002,282(3):L529-L539.

[5]Wu J H，Diamond S L. A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization,fibrinogenolysis,or fibrinolysis[J]. Anal Biochem,1995,224(1):83-91.

[6]Chan F K L,Ching J Y L,Hung L C T,etal. Clopidogrelversusaspirin and esomeprazole to prevent recurrent ulcer bleeding[J]. N Engl J Med，2005,352(3):238-244.

[7]Jankun J，Skrzypczak-Jankun E. Molecular basis of specific inhibition of urokinase plasminogen activator by amiloride[J]. Cancer Biochem Biophys,1999,17(1-2):109-123.

[8]Witt W，Baldus B，Bringmann P,etal. Thrombolytic properties of Desmodus rotundus (vampire bat) salivary plasminogen activator in experimental pulmonary embolism in rats[J]. Blood,1992,79(5):1213-1217.

[修回日期]2015-03-09

[本文編輯]陽(yáng)凌燕