■王曉帆 張幸怡 郝小燕 張立陽 丁 雪 薛世崇 李 高 張永根

(東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，黑龍江哈爾濱 150030)

蛋白質(zhì)含量是評定玉米青貯品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標之一。傳統(tǒng)的化學分析方法一般是通過組織均化和成分分離來實現(xiàn)對已知特定化學成分的測定。但是并沒有考慮到測定成分的空間構(gòu)象和分布。這不僅丟失了化學組成的內(nèi)在結(jié)構(gòu)信息，測量起來更加的耗時、費力，也伴隨著樣品浪費、環(huán)境污染等問題。與傳統(tǒng)化學分析方法破壞蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同，傅里葉紅外光譜（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，F(xiàn)TIR）是一種快速、無損、環(huán)保的分子結(jié)構(gòu)特征分析技術(shù)。Barth A等總結(jié)了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊和少量的β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲組成，這些二級結(jié)構(gòu)信息（酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶的峰高、峰面積以及比值，α-螺旋和β-折疊的峰高以及比值）對蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值有所影響。目前用此種技術(shù)來探究反芻動物粗飼料蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)組分關(guān)系的研究還很少。故本試驗重在利用FTIR技術(shù)對玉米青貯進行光譜分析，以期探索蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與營養(yǎng)組分間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

全株玉米青貯樣品共計15份，每份取兩個平行樣品。分別采集于不同時間（2014年5月至2014年9月）、黑龍江省不同地區(qū)的奶牛養(yǎng)殖場。青貯玉米的種類不同（先玉335、綏玉7、金嶺17、中原單32、陽光1號、墾單10等），青貯方式均為窖貯。

采集后的樣品經(jīng)過65℃烘干、粉碎過1 mm網(wǎng)篩，用于化學分析。粉碎過100目網(wǎng)篩，用于蛋白質(zhì)光譜分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 化學分析指標

干物質(zhì)（DM）、粗蛋白（CP）的測定參照張麗英方法?？扇苄缘鞍祝╯oluble protein，SP）的分析依照Krishnamoorthy方法。非蛋白氮（non-protein nitrogen，NPN）的測定按照AACC的方法測定。中性洗滌不溶蛋白（neutral detergent insoluble crude protein，NDICP）和酸性洗滌不溶蛋白（acid detergent insoluble crude protein，ADICP）按照Tcitra的方法進行測量。

1.2.2 中紅外光譜的采集

試驗采用的儀器為BRUKER ALPHA中紅外光譜儀，德國布魯克光譜儀器公司。

混有200 mg溴化鉀的2 mg樣品在瑪瑙研缽中充分研磨、混勻、壓片，放入光譜儀中進行讀取分析。光譜采集時儀器的設(shè)定參數(shù)：掃描范圍為700～4 000 cm-1（見圖1）。掃描次數(shù)為128次，分辨率為4 cm-1，每個樣品重復裝樣5次（見圖2）。

圖1 15種玉米青貯4 000～700 cm-1區(qū)域的中紅外光譜

圖2 玉米青貯5次測量圖譜的酰胺區(qū)域劃分

1.3 數(shù)據(jù)分析與計算

1.3.1 CNCPS蛋白質(zhì)組分的計算

按Sniffen的計算方法計算：

其中，NPN(%SP)為非蛋白氮占可溶性蛋白的百分比；SP(%CP)為可溶性蛋白占粗蛋白的百分比；NPN(%CP)為非蛋白氮占粗蛋白的百分比；NDICP(%CP)為中性洗滌不溶蛋白占粗蛋白的百分比；ADICP(%CP)為酸性洗滌不溶蛋白占粗蛋白的百分比。PA(%CP)為快速降解部分，即為非蛋白氮占粗蛋白的百分比；PB1(%CP)為溶于緩沖液中的真蛋白占粗蛋白的百分比；PB2(%CP)為中性洗滌可溶性蛋白占粗蛋白的百分比；PB3(%CP)為酸性洗滌可溶性蛋白占粗蛋白的百分比；PC(%CP)為酸性洗劑不溶性蛋白，即為不可利用的蛋白部分。

1.3.2 中紅外光譜分析

利用Ominic 8.2(Spectratech,Madison,WI,USA)光譜處理軟件對1 720～1 480 cm-1蛋白質(zhì)光譜區(qū)段進行分析，并分別對酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶進行基線校正。對酰胺Ⅰ帶區(qū)段進行二階導處理，并對二階導圖譜進行平滑。根據(jù)平滑后的二階導圖譜，找到原光譜對應的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)關(guān)系：α-螺旋出現(xiàn)在1 658～1 648 cm-1波段；β-折疊出現(xiàn)在1 640～1 620 cm-1波段。根據(jù)對酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶的峰高、峰面積、峰高比、峰面積比，以及二級結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-折疊的峰高、峰高比進行計算，探索玉米青貯分子營養(yǎng)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)組分的相關(guān)性。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用SAS 9.2軟件的PROC CORR程序分別檢測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)光譜酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶的峰面積、峰高、峰面積比和峰高比，二級結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-折疊的峰高、峰高比與全株玉米青貯的化學營養(yǎng)成分和CNCPS蛋白質(zhì)組分的相關(guān)性，并進行PROC REG程序的多元回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)營養(yǎng)成分與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)光譜的相關(guān)性

表1 玉米青貯化學成分和CNCPS蛋白質(zhì)組分與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)光譜的相關(guān)性

表1（續(xù)） 玉米青貯化學成分和CNCPS蛋白質(zhì)組分與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)光譜的相關(guān)性

由表1可知，玉米青貯的基本營養(yǎng)成分含量與其蛋白質(zhì)光譜結(jié)構(gòu)存在一定的相關(guān)性。

玉米青貯的粗蛋白含量分別與酰胺Ⅰ帶的峰面積、酰胺Ⅰ帶的峰高、α-螺旋峰高、β-折疊的峰高極顯著正相關(guān)（r=0.593～0.672，P≤0.001），與酰胺Ⅱ帶的峰高趨于相關(guān)（r=0.338，P=0.067），而與酰胺Ⅱ帶的峰面積、酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶的峰面積比、峰高比、α-螺旋和β-折疊的峰高比無相關(guān)。

玉米青貯中可溶性蛋白的含量分別與酰胺Ⅰ帶的峰面積、酰胺Ⅰ帶的峰高和β-折疊的峰高極顯著相關(guān)（r=0.510～0.543，P＜0.010），與α-螺旋的峰高（r=0.371，P=0.043）、酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶的峰高比（r=0.368，P=0.045）存在相關(guān)，與酰胺Ⅱ帶的峰面積、酰胺Ⅱ帶的峰高、酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶的峰面積比、α-螺旋和β-折疊的峰高比無相關(guān)關(guān)系。

玉米青貯中非蛋白氮的含量與酰胺Ⅰ帶的峰高極顯著正相關(guān)（r=0.483，P=0.007），與酰胺Ⅰ帶的峰面積（r=0.448，P=0.013）和β-折疊的峰高（r=0.396，P=0.030）存在相關(guān)，與酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶的峰高比趨于相關(guān)（r=0.329，P=0.076）。

玉米青貯的中性洗滌不溶蛋白和酸性洗滌不溶蛋白的含量與酰胺Ⅰ帶的峰面積、α-螺旋的峰高和β-折疊的峰高呈極顯著正相關(guān)（r=0.567～0.731，P≤0.001），與酰胺Ⅰ帶的峰高存在相關(guān)（r=0.451～0.460，P=0.011～0.013），與酰胺Ⅱ帶的峰面積、酰胺Ⅱ帶的峰高、酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶的峰面積比、酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶的峰高比、α-螺旋和β-折疊的峰高比不存在相關(guān)性。

由表2可以發(fā)現(xiàn)，可以利用酰胺Ⅰ帶的面積以及α-螺旋和β-折疊的峰高比對玉米青貯蛋白質(zhì)的含量建立回歸方程（R2=0.572，P＜0.001），同時酰胺Ⅰ帶的面積也是影響青貯可溶性蛋白含量的重要因素之一，可利用其對SP含量建立回歸方程（R2=0.299，P=0.002）。酰胺Ⅰ帶的峰高可以與玉米青貯非蛋白氮含量建立回歸方程（R2=0.234，P=0.007）。α-螺旋峰高和酰胺Ⅱ帶的峰面積可以擬合玉米青貯中酸性洗滌不溶蛋白的含量（R2=0.458，P=0.000），同時還可以利用α-螺旋的峰高與青貯中性洗滌不溶蛋白的含量建立回歸方程（R2=0.534，P＜0.001）。

2.2 CNCPS中蛋白質(zhì)組分與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)光譜的相關(guān)性

綜合表1、表2可知，PA組分與酰胺Ⅱ帶的峰面積、α-螺旋和β-折疊的峰高比存在負相關(guān)（r=-0.424，P=0.019～0.020），與酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶的峰高比存在正相關(guān)（r=0.428，P=0.018）。在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中，酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶的峰高比和α-螺旋與β-折疊的峰高比可以用來估算PA組分的含量，并建立回歸方程（R2=0.333，P=0.018）。

PB1組分與α-螺旋的峰高呈顯著正相關(guān)（r=0.527，P=0.003），故可利用α-螺旋的峰高建立對PB1組分的回歸方程（R2=0.278，P=0.003）。β-折疊的峰高與PB1組分存在相關(guān)（r=0.454，P=0.012），酰胺Ⅰ帶的峰面積與PB1也存在相關(guān)（r=0.348，P=0.059）。

酰胺Ⅰ帶的峰面積、峰高，酰胺Ⅱ帶的峰面積、α-螺旋的峰高、β-折疊的峰高、酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶的峰面積比、峰高比均與PB2組分呈極顯著相關(guān)（P＜0.001），其中除與酰胺Ⅱ帶的峰面積呈極顯著程度的正相關(guān)（r=0.509）外，其余均呈極顯著負相關(guān)（r=-0.799～-0.473）。其中可利用酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶的峰高比以及α-螺旋的峰高與PB2建立回歸方程（R2=0.796，P＜0.001）。

PB3組分與α-螺旋的峰高、酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶的峰面積比、峰高比呈顯著正相關(guān)（r=0.499～0.649，P＜0.005），其中α-螺旋的峰高和酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶的峰面積比對PB3組分更為相關(guān)，故可用來估算PB3組分并建立回歸方程（R2=0.521，P＜0.001）。

PC與α-螺旋的峰高呈極顯著正相關(guān)（r=0.465，P=0.010），回歸方程的決定系數(shù)為0.216。

3 討論

蛋白質(zhì)擁有獨特的分子結(jié)構(gòu)，其對應的光譜也具有獨特性。蛋白質(zhì)的光譜信息（峰高、官能團的比例）與蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值關(guān)系緊密。

3.1 基礎(chǔ)營養(yǎng)成分與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)光譜的相關(guān)性

蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶區(qū)域主要是由80%的C=O伸縮振動和C-N的伸縮振動組成，蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ帶區(qū)域主要為60%的N-H彎曲振動和C-N伸縮振動。酰胺Ⅰ帶的伸縮振動主要與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相關(guān)，并可以用于預測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。本文中酰胺Ⅰ帶的峰高和峰面積與CP、SP、NPN、NDICP、ADICP均存在正相關(guān)，與此一致。但酰胺Ⅱ帶的峰高除與粗蛋白趨于正相關(guān)外，與其它營養(yǎng)指標無相關(guān)。這可能是因為酰胺Ⅱ帶區(qū)域涉及到了多種官能團的伸縮振動，波譜較復雜，對蛋白質(zhì)的預測能力不如酰胺Ⅰ帶。Zhang等也分析可能因此原因只得到了粗蛋白的含量與酰胺Ⅰ帶的面積存在正相關(guān)。Yu在比較6種DDGS營養(yǎng)價值與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)時，提及酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶的峰面積與SP呈顯著正相關(guān)，與NDICP趨于正相關(guān)，與ADICP不存在相關(guān)性。而本文并未發(fā)現(xiàn)此相關(guān)性，差異的原因可能是因為飼料的種類不同，導致相應的分子結(jié)構(gòu)也不同，有相關(guān)性的指標被重新分配。

本文中α-螺旋和β-折疊的峰高比與基本營養(yǎng)指標無相關(guān)，而K.Doiron在研究三種不同溫度對亞麻籽影響時得到其峰高比值與NDICP、ADICP呈顯著相關(guān)?？赡茉虺戏N類不同帶來的差異外，還有可能是因為熱處理改變了分子結(jié)構(gòu)與構(gòu)象。這一點Yu在比較亞麻籽和北美駝絨藜籽蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)各組分比值以及相互關(guān)系時就表明，不同蛋白質(zhì)源的飼料，內(nèi)部結(jié)構(gòu)也不相同，飼料蛋白中α-螺旋和β-折疊的比值不同，其蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值也不同。

3.2 CNCPS中蛋白質(zhì)組分與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)光譜的相關(guān)性

Yu在分析谷物和乙醇副產(chǎn)物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息時，指出α-螺旋的峰高和β-折疊的峰高均與蛋白質(zhì)PA、PC組分呈正相關(guān)，與PB2組分呈負相關(guān)。本文結(jié)論與之一致，并在相關(guān)的基礎(chǔ)上，建立了回歸方程，更形象地指出了蛋白質(zhì)組分PA、PC與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的關(guān)系。與PB3組分正相關(guān)，這可能是因為不同種類的飼料原料蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)不同。Mojtaba Yari指出酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶的峰高比與PB2呈顯著負相關(guān)。本文結(jié)果與之相同，并建立了相應的回歸方程。這可能是因為酰胺Ⅰ帶對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)存在特別相關(guān)的原因。

Yu在分析小麥DDGS、玉米DDGS及其混合DDGS得出α-螺旋與β-折疊的峰高比只與PC組分有關(guān)，與NPN、SP、NDICP、PB1、PB2、PB3均無相關(guān)性，本文結(jié)論與其存在較大差異，這可能是由于飼料的種類、產(chǎn)地、品種、加工方法和貯存方式等多方面的不同而造成的較大差異。Yu在研究羽毛、大麥、小麥、燕麥的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)時也得出飼料蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值不僅與粗蛋白質(zhì)總含量有關(guān)，更與其二級結(jié)構(gòu)有關(guān)。并說明光譜的二級結(jié)構(gòu)受蛋白質(zhì)樣品的種類、分子的組成、熱處理、壓強處理和轉(zhuǎn)基因等因素的影響。

飼料二級結(jié)構(gòu)對粗飼料，尤其是玉米青貯飼料的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的影響研究尚少，還有待繼續(xù)深入研究。

4 結(jié)論

利用FTIR技術(shù)對玉米青貯內(nèi)在蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)了光譜信息與蛋白質(zhì)組分的相關(guān)性，并根據(jù)其相關(guān)性建立了回歸方程，豐富了FTIR技術(shù)在快速分析粗飼料蛋白的營養(yǎng)價值上的應用。并初步確認，可以利用FTIR技術(shù)預測玉米青貯的蛋白營養(yǎng)價值。

（參考文獻32篇，刊略，需者可函索）