復雜生物樣品中馬來酸依那普利的快速分析新方法

楊天鳴，黃國貞，付海燕，周蓉，李鶴東，姜杜

(中南民族大學藥學院，湖北 武漢 430074)

摘要：建立了復雜生物基質中馬來酸依那普利的快速檢測新方法。運用高效液相色譜-二極管陣列(HPLC-DAD)檢測技術結合自加權交替三線性分解(SWATLD)二階校正算法直接快速測定血漿、唾液和尿液生物基質中馬來酸依那普利的含量，獲得血漿、唾液和尿液3種生物基質中馬來酸依那普利的平均回收率分別為(98.0±3.7)%、(98.1±6.0)% 和(100.8±3.4)%。通過分析品質因子，包括靈敏度(SEN)、選擇性(SEL)、檢測限(LOD)、檢測量(LOQ)和預測均方差(RMSEP)評估了該方法的性能，利用t-檢驗對結果進行了校驗。結果表明，該方法具有的“二階優(yōu)勢”可在不同生物基質樣中內源化學物質干擾共存下，有效分辨和定量分析馬來酸依那普利，結果準確可靠。

關鍵詞：馬來酸依那普利；HPLC-DAD；SWATLD；血漿；唾液；尿液

基金項目：國家“十二五”科技支撐計劃資助項目(2012BAI27B00)，國家自然科學基金資助項目(21205145)，中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助項目(CZZ10005，CZY12028，CZY13019)

收稿日期：2015-05-15

作者簡介：楊天鳴(1962-)，男，湖北黃岡人，教授，主要從事藥物分析、化學生物學方面的研究，E-mail：tm28y@aliyun．com；通訊作者：付海燕，副教授，E-mail：fuhaiyan@mail．scuec．edu．cn。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2015.09.017

中圖分類號：O 657.72文獻標識碼：A

馬來酸依那普利(enalapril maleate)是Ⅱ代長效血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)，主要用于治療原發(fā)性高血壓,是一種前體藥物[1]，水解后轉化為活性藥物，具有藥理作用平穩(wěn)、持續(xù)時間長、不良反應小、安全有效等特點[2-3]。

目前，馬來酸依那普利的常用分析方法有酶動力學法[4]、RP-HPLC法[1]、GC-MS法[5]、LC-MS法和HPLC-UV法[3]等。由于馬來酸依那普利的最大吸收波長為末端吸收，HPLC-UV法受結構相近的非待測藥物和代謝產物、內源性雜質的干擾，在分析生物樣品之前，通常要經過分離純化等處理過程；GC-MS和LC-MS法的樣品處理步驟繁瑣，且成本較高，不適合快速分析。鑒于此，作者采用HPLC-DAD結合化學計量學自加權交替三線性分解(SWATLD)[6]二階校正算法，在不需化學分離的情況下，實現了復雜生物基質中馬來酸依那普利的快速準確定量分析。

1實驗

1.1　算法理論簡介

1.1.1SWATLD算法及原理

SWATLD算法沿用ATLD算法思路，通過交替最小化3個新的具有內在聯系且與三線性模型相關的目標函數，來完成三維數據陣的分解。

SWATLD算法的目標函數為：

其中，diag(sqrt(1./diagm(ATA)))、diag(sqrt(1./diagm(BTB)))和diag(sqrt(1./diagm(CTC)))3個權重矩陣，以平衡每個目標函數中的2個部分。

SWATLD算法除具有其它算法的優(yōu)點外，如對組分數不敏感、收斂速度較快(一般迭代100次以內就可以收斂)，因有求平均值的計算步驟還具有對噪聲不太敏感的特征。與同類算法相比，SWATLD具有較好的分析性能。

1.1.2品質因子

本實驗所考察的分析方法的品質因子包括靈敏度(SEN)、選擇性(SEL)、檢測限(LOD)[7]、檢測量(LOQ)[7]和預測均方差(RMSEP)，計算方程為：

SEN = λ﹛[(ATA)·(BTB)]-1﹜nnT-1/2

(1)

SEL =﹛[(ATA)·(BTB)]-1﹜nnT-1/2

(2)

LOD = 3.3s(0)

(3)

LOQ = 10s(0)

(4)

(5)

式中：下標nn表示矩陣[(ATA)·(BTB)]-1中的第(n，n)個元素；λ為單位濃度下組分n的總信號，也稱為濃度得分參數；s(0)為采用二階校正算法平行分析3個空白背景之后得到預測濃度的標準偏差；cact和cpred分別為第i個實驗樣品的真實濃度和預測濃度；I為預測樣品的組分數。

1.2　材料、試劑與儀器

健康成年SD大鼠[SCXK(鄂)2008-0005]，購于湖北省實驗動物研究中心。

馬來酸依那普利標準品(批號：100705-200902)，中國藥品生物制品檢定所；磷酸，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇，色譜純，美國 Tedia 公司；肝素(150 U·mg-1,水分0.49%)；超純水。

Ultimate 3000型高效液相色譜儀(DAD二極管陣列檢測器，WPS-3000SL自動進樣器，LPG-3400SD四元梯度泵，TCC-3000RS柱溫箱，DIONEX Chromeleon色譜工作站),美國賽默飛-戴安有限公司；色譜柱：Syncronis C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm),美國Thermo有限公司;Allegra 64R型臺式高速冷凍離心機,美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3　方法

1.3.1色譜條件

流動相：65%甲醇-35%磷酸溶液(用磷酸調pH=3.5±0.1)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；檢測器：DAD；檢測波長：190～400 nm。

1.3.2標準溶液的配制

稱取馬來酸依那普利標準品0.0501 g于燒杯中，甲醇溶解后轉移至50 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，靜置，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.3校正樣和驗證樣的配制

用馬來酸依那普利標準溶液分別配制濃度(μg·mL-1)為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100的10個校正樣和濃度(μg·mL-1)分別為30、40、50、60、70、80的6個不加任何干擾物質的驗證樣(T1～T6)。

1.3.4生物樣品的制備

1.3.4.1生物樣品的預處理

大鼠血漿生物樣制備：取健康成年SD雄性大鼠6只，禁食(不禁飲水)12 h后，于大鼠眼眶靜脈叢采血約0.5 mL轉入1.5 mL離心管(用肝素潤濕并揮發(fā)干)，在4 ℃、4 000 r·min-1條件下離心5 min，用微量移液器吸取血漿，保存于-40 ℃冰箱，備用。

人唾液生物樣制備：收集未服藥的健康志愿者自然狀態(tài)下分泌的唾液，在4 ℃、4 000 r·min-1條件下離心5 min，用微量移液器吸取上層清液，備用。

人尿液生物樣制備：收集未服藥的健康男性志愿者晨尿，在4 ℃、4 000 r·min-1條件下離心5 min，用微量移液器吸取上層清液，備用。

1.3.4.2供試品的配制

配制9個含100 μL血漿的馬來酸依那普利濃度(μg·mL-1)分別為10、20、30、40、60、70、80、90、100的血漿基質樣品(P1～P9)以及3個只含100 μL血漿的血漿空白樣品；配制8個含500 μL唾液的馬來酸依那普利濃度(μg·mL-1)分別為30、40、50、60、70、80、90、100的唾液基質樣品(S1～S8)以及3個只含500 μL唾液的唾液空白樣品；配制10個含 100 μL尿液的馬來酸依那普利濃度(μg·mL-1)分別為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100的尿液基質樣品(U1～U10)以及3個只含100 μL尿液的尿液空白樣品。

2結果與討論

2.1　三維數據陣校正模型的構建和驗證

采用HPLC-DAD檢測儀器，獲得物質190～400 nm的檢測數據。已知馬來酸依那普利是一個復鹽，在HPLC檢測時會出現2個色譜峰。從馬來酸依那普利不同波長的高效液相色譜流出圖(圖1)中可以看到，在3.7 min有馬來酸的峰，依那普利則在4.4 min左右出峰。

為了用于數據解析，截取3.5～5.0 min和210～220 nm的色譜數據，組成451×11×16(校正樣+驗證樣)的三維數據陣模型。用SWATLD算法校正結果見表1。

圖1　馬來酸依那普利不同波長的高效液相色譜流出圖 Fig.1　HPLC Chromatogram of enalapril maleate at different wavelengths

2.2　復雜生物基質樣品中馬來酸依那普利的SWATLD定量解析

表1馬來酸依那普利驗證樣SWATLD算法校正分析結果

Tab.1Results of enalapril maleate validation samples
based on calibration of SWATLD algorithm

樣品編號 加入馬來酸依那普利濃度 μg·mL-1 回收率 %T130106.2T240107.9T35096.1T460103.2T570100.2T680100.7平均回收率/%102.4±4.3RMSEP/(μg·mL-1)4.90T(t-test)t50.05=2.011.34

2.2.1血漿基質樣品中馬來酸依那普利的解析

血漿基質樣品的三維高效液相色譜如圖2所示。

圖2　血漿基質樣品的三維高效液相色譜 Fig.2　Three-dimensional HPLC chromatogram of plasma matrix samples

由圖2可見，血漿空白樣品在實驗所選區(qū)域內對馬來酸依那普利的準確測定有一定的干擾。如果不對樣品進行化學分離，進行常規(guī)色譜檢測會造成困難，對分析結果有較大的影響。HPLC-DAD結合SWATLD算法能很好地解決這一問題，可以在空白干擾明顯的情況下，不需對樣品進行化學分離，直接實現對目標組分馬來酸依那普利的定量解析(表2)。

2.2.2唾液基質樣品中馬來酸依那普利的解析

唾液基質樣品的三維高效液相色譜如圖3所示。

圖3　唾液基質樣品的三維高效液相色譜 Fig.3　 Three-dimensional HPLC chromatogram of saliva matrix samples

由圖3可見，唾液空白樣品在實驗所選區(qū)域內對馬來酸依那普利的準確測定有一定的干擾，如果不對樣品進行化學分離，進行常規(guī)色譜檢測會造成困難，對分析結果有較大的影響。HPLC-DAD結合SWATLD算法不需對樣品進行化學分離，可直接實現對其中目標組分馬來酸依那普利的定量解析(表2)。

2.2.3尿液基質樣品中馬來酸依那普利的解析

尿液基質樣品的三維高效液相色譜如圖4所示。

圖4　尿液基質樣品的三維高效液相色譜 Fig.4　Three-dimensional HPLC chromatogram of urine matrix samples

由圖4可見，尿液空白樣品在實驗所選區(qū)域內對馬來酸依那普利的準確測定有一定的干擾，如果不對樣品進行化學分離，進行常規(guī)色譜檢測會造成困難，對分析結果有較大的影響。HPLC-DAD結合SWATLD算法不需對樣品進行化學分離，可直接實現對其中目標組分馬來酸依那普利的定量解析(表2)。

2.2.4不同生物基質樣品中馬來酸依那普利的SWATLD定量解析結果

分別截取血漿基質樣品、唾液基質樣品、尿液基質樣品3.5～5.0 min和210～220 nm的色譜數據與樣本(校正樣+預測樣)，組成451×11×19、451×11×18、451×11×20的三維數據陣模型，用SWATLD多維數據解析方法進行定量解析，結果見表2。

表2不同生物基質樣品中馬來酸依那普利的SWATLD定量解析結果

Tab.2Results of enalapril maleate in different biological matrices samples based
on calibration of SWATLD algorithm

血漿生物基質樣品樣品編號預測值/(μg·mL-1)回收率/%唾液生物基質樣品樣品編號預測值/(μg·mL-1)回收率/%尿液生物基質樣品樣品編號預測值/(μg·mL-1)回收率/%P110.42104.2S128.4394.8U19.4094.0P220.28101.4S243.96109.9U219.8499.2P330.56100.6S346.6293.3U330.39101.3P439.5698.9S455.4192.4U442.27105.7P559.7799.6S563.9891.4U552.61105.2P665.8794.1S680.20100.3U662.41104.0P773.7492.2S789.6899.6U768.4497.8P888.0397.8S8103.09103.1U881.61102.0P993.5393.5U990.57100.6U1098.4398.4平均回收率/%98.0±3.798.1±6.0 100.8±3.4 RMSEP/(μg·mL-1)2.863.45 1.41 T(t-test)1.47

由表2可知，對血漿基質樣品、唾液基質樣品和尿液基質樣品的平均回收率分別為(98.0±3.7)%、(98.1±6.0)%和(100.8±3.4)%；RMSEP分別為2.86 μg·mL-1、3.45 μg·mL-1和1.41 μg·mL-1，并且在95%的置信水平下，不同生物基質樣品的回收率和理想值100%所對應的t-檢驗結果沒有顯著性差異，說明SWATLD算法對于這3種生物基質樣品的預測結果具有統(tǒng)計學意義。

2.2.5品質因子的考察

SWATLD算法預測3種不同生物基質樣品中馬來酸依那普利的含量，其品質因子(靈敏度SEN、選擇性SEL、檢測限LOD、檢測量LOQ)考察結果見表3。

表3SWATLD算法品質因子考察結果

Tab.3Results of quality factors by SWATLD algorithm

樣品SELSENμg·mL-1LODμg·mL-1LOQμg·mL-1血漿0.0020.032.597.84唾液0.182.700.270.81尿液0.010.230.742.24

由表3可知，SWATLD算法對3種不同生物基質樣品中馬來酸依那普利的預測性能良好，能在復雜生物基質樣品中選擇性準確檢測目標組分。

3結論

運用高效液相色譜-二極管陣列(HPLC-DAD)檢測技術結合自加權交替三線性分解(SWATLD)二階校正算法直接快速測定血漿、唾液和尿液生物基質樣品中馬來酸依那普利的含量，與普通色譜檢測相比，無需進一步的提取分離以及優(yōu)化色譜分離條件等步驟，通過與SWATLD二階校正算法結合，利用該方法的“二階優(yōu)勢”，克服了血漿、唾液和尿液體系中未知組分的干擾，通過“數學分離”代替或部分代替“化學分離”，從而簡化了樣品預處理以及分析檢測的步驟，并減少有機溶劑的污染，同時也提高了分析效率，再次證明該方法的可行性及其在復雜生物樣品分析方面的巨大優(yōu)勢，為臨床實時快速準確定量分析體液中馬來酸依那普利含量提供一種新型的方法。

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A Method for Fast Determination of Enalapril Maleate

in Complex Biological Matrices

YANG Tian-ming,HUANG Guo-zhen,FU Hai-yan,ZHOU Rong,LI He-dong,JIANG Du

(CollegeofPharmacy,South-CentralUniversityforNationalities,Wuhan430074,China)

Abstract：A method for fast determination of enalapril maleate in complex biological matrices was developed.The content of enalapril maleate in plasma，saliva and urine matrices were directly and rapidly determinated by HPLC-DAD combined with the second-order correction algorithm of SWATLD.The average recovery of enalapril maleate in three biological matrices of plasma，saliva and urine were (98.0±3.7)%，(98.1±6.0)% and (100.8±3.4)%,respectively.The performance of the method was evaluated by analyzing the quality factors，including sensitivity(SEN)，selectivity(SEL)，limit of detection(LOD),limit of quantitation(LOQ) and RMSEP.t-Test was used to check the results. This method had the “second-order advantage”.Enalapril maleate was distinguished efficiently and analyzed quantitatively in the presence of different biological matrixs with endogenous substances,and the analytical results were accurate and reliable.

Keywords：enalapril maleate；HPLC-DAD；SWATLD；plasma；saliva；urine