doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.026

細(xì)胞微粒在自身免疫性疾病發(fā)病中的作用:一種新的潛在治療靶標(biāo)①

廖煥金蘭巧芬陳秋華②謝彤②吳平劉華鋒③潘慶軍③

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心,湛江 524001)

中圖分類(lèi)號(hào)R392

文獻(xiàn)標(biāo)志碼碼A

文章編號(hào)號(hào)1000-484X(2015)11-1557-04

①本文受?chē)?guó)家自然科學(xué)基金(81471530),廣東省自然科學(xué)基金(S2013010011568),湛江市科技攻關(guān)項(xiàng)目(2013B01086)資助。

②廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,湛江524001。

③廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎臟疾病研究所,湛江524001。

作者簡(jiǎn)介：廖煥金(1990年-),男,主要從事自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制研究。

通訊作者及指導(dǎo)教師：謝彤(1967年-),男,主任醫(yī)師,主要從事風(fēng)濕免疫性疾病防治研究,E-mail:xtR34@163.com。

劉華鋒(1969年-),男,教授,博導(dǎo),主要從事免疫性腎小球疾病發(fā)病機(jī)制方面的研究,E-mail:hf-liu@263.net。

潘慶軍(1978年-),男,博士,副教授,碩導(dǎo),主要自身免疫性疾病防治研究,E-mail:stilwapan@gmail.com。

細(xì)胞微粒(Microparticles,MPs) 是一類(lèi)在某些生理或病理狀況下，從血管內(nèi)皮細(xì)胞或循環(huán)血細(xì)胞 出芽脫落的富含磷脂的直徑約為0.1~1.0 μm的顆粒，具有生物活性可參與多種免疫性疾病(Immune diseases)的發(fā)病[1]。微粒被認(rèn)為是多功能的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，通過(guò)釋放生物活性分子和表面抗原與靶細(xì)胞的受體相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，傳遞分子物質(zhì)和誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)[2,3]。因此，細(xì)胞微粒可能作為自身免疫性疾病新的潛在治療靶標(biāo)。

本文謹(jǐn)對(duì)細(xì)胞微粒在自身免疫性疾病發(fā)病中的作用做一綜述，以類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatic arthritis,RA)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)為例，以期為自身免疫性疾病的防治提供新的策略。

1細(xì)胞微粒的生成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和檢測(cè)

細(xì)胞凋亡和活化是釋放微粒的主要機(jī)制[4，5]。通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞活化或凋亡，使之出芽產(chǎn)生微粒是研究微粒功能的重要手段。在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)發(fā)病中，抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCAs)可誘導(dǎo)細(xì)胞因子型中性粒細(xì)胞釋放微粒[6]。另外，一種廣泛使用的蛋白抑制劑即星形孢菌素可以誘導(dǎo)凋亡促進(jìn)囊泡的形成，然后分離成為微粒[7]。因此，對(duì)不同微粒誘導(dǎo)劑的發(fā)現(xiàn)，有利于我們進(jìn)一步探索微粒的形成、釋放機(jī)制，以及其生物學(xué)功能。

微粒其在細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)和生物活性分子傳遞中具有重要的作用。免疫性疾病中，與疾病相關(guān)的微粒主要是內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血小板等活化和凋亡產(chǎn)生的[8]。微粒內(nèi)含有DNA、RNA、蛋白質(zhì)、補(bǔ)體、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等，而且膜上具有各種前體細(xì)胞的表面受體(如CD31、CD40、CD40L、CD4、CD5、CD105等)[1,8,9]。這些微粒可以在外周血中進(jìn)行廣泛的轉(zhuǎn)移，通過(guò)釋放生物活性物質(zhì)和表面受體與靶受體相互識(shí)別，進(jìn)而參與免疫性疾病的發(fā)病。

微粒的精確分離和檢測(cè)也尤為重要。微粒的檢測(cè)方法主要有掃描電子顯微鏡、流式細(xì)胞儀和ELISA等，由于通量高、用時(shí)短、操作簡(jiǎn)單，ELISA和流式細(xì)胞儀是目前比較常用的方法[10]。檢測(cè)原理主要基于微粒攜帶了前體細(xì)胞的一些表面抗原和胞質(zhì)中的蛋白抗原、DNA、RNA等，因此可通過(guò)對(duì)微粒表面特異抗原和胞質(zhì)成分的檢測(cè)來(lái)鑒別和分離微粒[7]。研究發(fā)現(xiàn)，還可以用核酸染料來(lái)檢測(cè)微粒內(nèi)的DNA和RNA確定其來(lái)源[11]。雖然可以通過(guò)檢測(cè)表面特異抗原和胞質(zhì)成分來(lái)分離和鑒別微粒，但微粒的檢測(cè)常常受到其大小和體液中的可溶性分子限制。同時(shí)，對(duì)于直徑小于0.3 μm的微粒體很難分離檢測(cè)到，而且易受一些主觀因素的影響，很難使整個(gè)檢測(cè)過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)化[10]。

2細(xì)胞微粒在RA發(fā)病中的作用

RA是一種常見(jiàn)的自身免疫性疾病，其特征以慢性關(guān)節(jié)炎癥為主，易反復(fù)發(fā)作，最終出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形甚至不同程度的殘疾[12,13]。既往發(fā)現(xiàn)免疫異常、遺傳背景、環(huán)境差異和表觀遺傳修飾等因素可以使自身抗體的產(chǎn)生增加、促進(jìn)關(guān)節(jié)炎癥和骨破壞[14]，但其發(fā)病機(jī)制仍未完全解析。近年研究發(fā)現(xiàn)，微粒被認(rèn)為是細(xì)胞損傷和活化的分子標(biāo)志物，也是新的信號(hào)傳遞物質(zhì)。血小板、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞產(chǎn)生的微粒攜帶的多種胞質(zhì)成分及表面抗原在RA的免疫應(yīng)答異常中可能具有重要作用。

十多年前，Knifjj-Dutmer等[1]已證實(shí)血中PMPs水平與RA疾病的活動(dòng)度密切相關(guān)，來(lái)自臨床RA病人活動(dòng)期和非活動(dòng)期的血漿PMP高于健康對(duì)照組。從而開(kāi)啟了微粒在免疫性疾病發(fā)病中的研究熱潮。近年研究發(fā)現(xiàn)，RA病人血漿和滑膜液中的微粒數(shù)量都有所升高[15]。在體外檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，從RA病人分離的微?？梢源龠M(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活化和損害人的血管內(nèi)皮細(xì)胞及其功能[16]。但目前，在RA中，微粒的種類(lèi)，微粒主要來(lái)源于何種細(xì)胞，通過(guò)何種途徑影響信號(hào)傳導(dǎo)，對(duì)疾病發(fā)展的影響尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

在RA的發(fā)病中，炎癥反應(yīng)是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。眾多炎性和免疫細(xì)胞(如樹(shù)突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞等)與 RA的疾病進(jìn)展密切相關(guān)。已發(fā)現(xiàn)體外產(chǎn)生的EMP能夠刺激黏附分子的表達(dá)，增加單核細(xì)胞黏附，促進(jìn)炎性細(xì)胞聚集，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[17]。除影響單核細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)外，微粒還能夠促進(jìn)一些炎癥因子的表達(dá)。已報(bào)道，來(lái)源于RA或骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)滑膜液的微粒與成纖維樣滑膜細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)可以誘導(dǎo)生成IL-6、IL-8、MCP-1、RANTES和VEGF[18]，微粒增高可使體內(nèi)C反應(yīng)蛋白(CRP)的水平增高[19]。此外，TNF-α刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的EMP可以誘導(dǎo)漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞(Plasmacytoid dendritic cells,pDC)成熟，成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞不僅能夠分泌炎性細(xì)胞因子如IL-6、IL-8[20]，還可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞向Th1分化[21]。Th1細(xì)胞分泌的因子(如IFN-γ、IL-2和TNF-α)已被證明可促進(jìn)RA的發(fā)展[14]。

在自身免疫性疾病中，微粒、免疫球蛋白和補(bǔ)體能夠形成促進(jìn)炎癥發(fā)生的免疫復(fù)合物(Immune complexes,ICs)。補(bǔ)體在RA的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，有證據(jù)表明在人類(lèi)RA滑膜和RA的動(dòng)物模型中可以通過(guò)經(jīng)典途徑和旁路途徑激活補(bǔ)體[22]。并且，已發(fā)現(xiàn)在RA病人軟骨中含有免疫球蛋白和C3沉積物。而且，在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎和其他RA小鼠模型中，關(guān)節(jié)炎依賴(lài)于補(bǔ)體的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[23]。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在RA滑膜液中可檢測(cè)到細(xì)胞來(lái)源的微粒與補(bǔ)體形成的復(fù)合物。在對(duì)RA滑膜液中的微粒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，微粒的大小不同，推測(cè)大的微粒是微粒-ICS復(fù)合物(MP-ICS)，是基于免疫復(fù)合物中含有大量來(lái)源于血小板及表達(dá)CD41的微粒，另外MP-ICS有很高的促炎作用，可引起中性粒細(xì)胞白三烯的釋放[24]。這些發(fā)現(xiàn)表明微?？梢院脱a(bǔ)體形成免疫復(fù)合物并參與RA的發(fā)病。據(jù)此，我們推測(cè)表達(dá)自身抗原的血小板微粒與抗體或補(bǔ)體形成的MP-ICS可能是導(dǎo)致炎癥持續(xù)存在的原因之一。

T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)異常是類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的主要發(fā)病機(jī)制，如Th1/Th2和Th17/Treg等應(yīng)答失衡。在RA中，內(nèi)皮細(xì)胞活化后可作為抗原提呈細(xì)胞(APC)向T細(xì)胞遞呈抗原，并表達(dá)與淋巴細(xì)胞表面配體相互作用的多種分子。研究發(fā)現(xiàn)，微粒攜帶的多種表面分子可能為APC與T細(xì)胞間的相互作用創(chuàng)造了條件，參與了T細(xì)胞的活化和增殖[25]。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)，在RA中，微粒可刺激T細(xì)胞活化，誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子(IFN-γ和IL-2)，提示微?？赏ㄟ^(guò)活化T細(xì)胞并產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)，介導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答[21]。

B細(xì)胞可通過(guò)抗原提呈和分泌抗體，在RA適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。PMPs通過(guò)攜帶的CD40L可以調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的發(fā)生。這些微?？蓚鬟f活化信號(hào)給B細(xì)胞，進(jìn)而分泌更多的IgG，經(jīng)CD4+T細(xì)胞協(xié)同作用后，可進(jìn)一步形成生發(fā)中心(Germinal center)[26]。另外，BAFF(B-cell activating factor,BAFF)是腫瘤壞死家族的一員，對(duì)B細(xì)胞的活化，增殖和抗凋亡至關(guān)重要。Messer等[27]在體外研究中發(fā)現(xiàn)，從類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎患者的滑膜液中分離的微粒能夠誘導(dǎo)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(Fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)釋放B細(xì)胞活化因子(B cell-activating factor,BAFF)、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(Thymic stroma lymphopoietin，TSLP)和分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑(Secretory eukocyte protease inhibitor,SLPI )，進(jìn)而影響B(tài)細(xì)胞增殖活化。因此，微?？赏ㄟ^(guò)影響B(tài)細(xì)胞的功能參與RA的發(fā)病，但具體機(jī)制有待深入研究。

綜上，在RA中微?？赡芡ㄟ^(guò)細(xì)胞表面分子和釋放胞質(zhì)的成分，在激活血小板釋放炎癥介質(zhì)、B細(xì)胞和T細(xì)胞活化、介導(dǎo)抗體的生成和激活補(bǔ)體形成免疫復(fù)合物等過(guò)程中扮演重要角色。此外，研究還發(fā)現(xiàn)來(lái)源于T細(xì)胞和單核細(xì)胞的微?？梢哉T導(dǎo)滑膜纖維細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)蛋白酶和產(chǎn)生介質(zhì)[28]，說(shuō)明微?？赡苓€會(huì)促進(jìn)RA關(guān)節(jié)軟骨和骨骼的破壞，甚至出現(xiàn)畸形，可能作為一種新的RA的潛在治療靶標(biāo)。

3細(xì)胞微粒在SLE發(fā)病中的作用

SLE是一種慢性自身免疫性炎癥疾病，常累及全身多系統(tǒng)、多器官，典型特征為多種自身抗體及免疫復(fù)合物的形成，主要病理特征是免疫復(fù)合物沉積在組織造成SLE患者的炎癥反應(yīng)[29]。遺傳和環(huán)境因素相互作用導(dǎo)致的免疫細(xì)胞功能紊亂與SLE密切相關(guān)。雖然SLE中免疫復(fù)合物的作用已經(jīng)明確，但免疫復(fù)合物中核抗原來(lái)源還仍不清楚。所以研究微粒在(核)抗原的來(lái)源和免疫復(fù)合物的形成過(guò)程所起作用，將有助于解析SLE的發(fā)病機(jī)制。

凋亡調(diào)節(jié)紊亂或吞噬凋亡小體異常是SLE發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究已發(fā)現(xiàn)，自身抗原物質(zhì)可能來(lái)源于凋亡細(xì)胞，與凋亡小體的清除異常密切相關(guān)。在細(xì)胞凋亡分子重組中，RNA和DNA被包裝成凋亡小體，小的凋亡小體和微粒容易逃過(guò)被吞噬的命運(yùn)，可以轉(zhuǎn)移到外周血中或與抗體形成免疫復(fù)合物沉積在組織，從而影響人的生理活動(dòng)[30,31]。Radic等[32]研究表明在細(xì)胞凋亡時(shí)，用共聚焦顯微鏡和單克隆自身抗體分子重組技術(shù)發(fā)現(xiàn)凋亡小體含有DNA、組蛋白、組蛋白-DNA復(fù)合物和核小體顆粒。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)組蛋白、DNA、RNA和SSB抗原出現(xiàn)在被巨噬細(xì)胞吞噬的凋亡小體中[33]。這些研究表明自身抗原物質(zhì)可能來(lái)源于凋亡小體或凋亡產(chǎn)生的微粒。當(dāng)?shù)蛲稣{(diào)節(jié)紊亂或吞噬凋亡小體異常時(shí)可誘發(fā)SLE。

盡管SLE的發(fā)病機(jī)制仍不明確，但免疫調(diào)節(jié)紊亂貫穿整個(gè)發(fā)病過(guò)程，主要以異常B細(xì)胞失調(diào)產(chǎn)生大量自身抗體、炎癥T細(xì)胞浸潤(rùn)至靶器官及抗原呈遞細(xì)胞功能異常為特征。如微粒在RA中的作用中所述，微粒包含相關(guān)的自身抗原及內(nèi)容物能夠刺激B和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。一旦誘導(dǎo)產(chǎn)生抗核抗體，就可以通過(guò)激活樹(shù)突狀漿細(xì)胞產(chǎn)生干擾素等細(xì)胞因子，或者和核抗原形成免疫復(fù)合物沉積在組織中。

基于，微粒是在細(xì)胞死亡和激活時(shí)釋放含有核分子的質(zhì)膜囊泡，DNA是微粒的一個(gè)重要組成部分，在血液中的DNA存在游離和顆粒兩種形式。因此在SLE中，微?？勺鳛榭笵NA抗體和抗核小體抗體的靶抗原，與血液中的抗核抗體形成免疫復(fù)合物沉積在組織中。研究發(fā)現(xiàn)，位于腎臟中的這些復(fù)合物包含IgM，IgG，IgA和補(bǔ)體，能夠?qū)е吕钳從I炎(Lupus nephritis,LN)的發(fā)生[34]。Ullal等[35]研究發(fā)現(xiàn)SLE患者血液中，IgG陽(yáng)性的微粒水平增加時(shí)，總微粒數(shù)量也會(huì)有所增加。在人類(lèi)SLE和小鼠模型中研究IgG陽(yáng)性的微粒數(shù)量和抗DNA水平之間的關(guān)系時(shí)也提示微粒是免疫復(fù)合物的重要來(lái)源。Nielsen等研究表明未結(jié)合細(xì)胞源性微粒的膜聯(lián)蛋白V的水平與SLE的疾病活動(dòng)度、腎炎活動(dòng)度、高血壓、動(dòng)脈血栓形成病史和甘油酸水平有關(guān)[36]。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，除在RA血清中IgM陽(yáng)性的微粒外，SLE病人血細(xì)胞來(lái)源的微粒與正常對(duì)照組、RA病人組和系統(tǒng)性硬化癥相比，IgG、IgM和C1q陽(yáng)性的微粒水平升都有所上升[37]。所以IgG陽(yáng)性的微粒與典型狼瘡抗體密切相關(guān)(抗-dsDNA，抗-ENA和抗-組蛋白等)。在檢測(cè)NZB/NZWF1狼瘡小鼠的抗DNA抗體與THP-1和Jurkat凋亡細(xì)胞產(chǎn)生微粒的結(jié)合試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，只有某些確定的抗DNA抗體能結(jié)合微粒，特別是結(jié)合雙鏈DNA[38]。

圖1　細(xì)胞微粒參與自身免疫性疾病發(fā)病的假說(shuō)Fig.1　A hypothesis of function of microparticles in development of autoimmune diseases

綜上，特定微粒的數(shù)量可能與SLE的疾病活動(dòng)度密切相關(guān)，并提示微粒是免疫復(fù)合物的一個(gè)重要來(lái)源，可能作為一種新的SLE的潛在治療靶標(biāo)。

5結(jié)論

細(xì)胞微粒在自身免疫性疾病的發(fā)病中是具有功能多樣化的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是細(xì)胞損傷和活化的標(biāo)志物，也是新的信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)。在RA中，這些微粒攜帶促炎物質(zhì)可引起滑膜炎，也可活化淋巴細(xì)胞，介導(dǎo)抗體的產(chǎn)生。在SLE中，微粒在信號(hào)傳導(dǎo)和免疫復(fù)合物的形成中扮演重要角色，可作為自身抗原的載體并啟動(dòng)和維持自身抗體的產(chǎn)生。因此，細(xì)胞微粒有望作為自身免疫性疾病新的潛在治療靶標(biāo)。

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[收稿2015-03-20修回2015-04-13]

(編輯許四平)