羅　超　沈　立　呂　昌

(紹興文理學(xué)院元培學(xué)院，紹興312000)

[摘　要]　目的：探討亥茅酚苷對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞株RAW264.7炎癥介質(zhì)及細胞因子(NO、IL-6)釋放的影響。方法：應(yīng)用LPS(1 μg/ml)刺激RAW264.7細胞，采用不同濃度亥茅酚苷(20、40、80 μg/ml)干預(yù)，Griess試劑法測定NO釋放量；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定IL-6釋放，用免疫印跡法(Western blot)檢測細胞一氧化氮合酶(iNOS)的表達，實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)分析iNOS、IL-6 mRNA的表達。結(jié)果：亥茅酚苷各劑量組(20、40、80 μg/ml)均能抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞NO、IL-6的釋放(P<0.01)，并下調(diào)iNOS 蛋白、iNOS mRNA、IL-6 mRNA的表達。結(jié)論：亥茅酚苷對LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞NO、IL-6釋放和iNOS表達有抑制作用，具有一定的抗炎活性。

[關(guān)鍵詞]　亥茅酚苷；巨噬細胞；炎癥；一氧化氮；白介素6

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.009

亥茅酚苷對脂多糖誘導(dǎo)巨噬細胞一氧化氮和白介素6表達的影響

羅超沈立呂昌①

(紹興文理學(xué)院元培學(xué)院，紹興312000)

[摘要]目的：探討亥茅酚苷對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞株RAW264.7炎癥介質(zhì)及細胞因子(NO、IL-6)釋放的影響。方法：應(yīng)用LPS(1 μg/ml)刺激RAW264.7細胞，采用不同濃度亥茅酚苷(20、40、80 μg/ml)干預(yù)，Griess試劑法測定NO釋放量；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定IL-6釋放，用免疫印跡法(Western blot)檢測細胞一氧化氮合酶(iNOS)的表達，實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)分析iNOS、IL-6 mRNA的表達。結(jié)果：亥茅酚苷各劑量組(20、40、80 μg/ml)均能抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞NO、IL-6的釋放(P<0.01)，并下調(diào)iNOS 蛋白、iNOS mRNA、IL-6 mRNA的表達。結(jié)論：亥茅酚苷對LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞NO、IL-6釋放和iNOS表達有抑制作用，具有一定的抗炎活性。

[關(guān)鍵詞]亥茅酚苷；巨噬細胞；炎癥；一氧化氮；白介素6

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.009

中圖分類號R392

文獻標志碼碼A

文章編號號1000-484X(2015)11-1486-04

通訊作者①，廣東省婦幼保健院藥學(xué)部，廣州510010，E-mail:iml-ch@163.com。

作者簡介：羅超(1985年-)，男，講師，主要從事新藥評價研究，E-mail:luofish01@163.com。

[Abstract]Objective:To investigate the effect of Sec-O-Glucosylhamaudol on inflammatory mediator and cytokine(NO and IL-6)production in Lipopolysaccharide(LPS)stimulated murine macrophage(RAW264.7).Methods: Macrophages were induced with LPS，and incubated with different concentrations of Sec-O-Glucosylhamaudol(20，40，80 μg/ml)，the quantity of NO production was measured by Griess reagent；the IL-6 production were measured by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)，the expression of nitric oxide synthase(iNOS)in cells were detected by Western blot；the expression of iNOS and IL-6 mRNA were analyzed by real-time PCR.Results: Each concentrations of Sec-O-Glucosylhamaudol(20，40，80 μg/ml)inhibited the production of NO and IL-6 in LPS-stimulated RAW264.7 cells(P<0.01).This compound also reduced the mRNA expression of iNOS and IL-6.Conclusion: Sec-O-Glucosylhamaudol exhibited anti-inflammatory activity by inhibited the NO and IL-6 production in LPS stimulated RAW264.7 cells.

Effects of Sec-O-Glucosylhamaudol on expressions of nitric oxide and interleukin-6 in Lipopolysaccharide stimulated murine macrophage

LUOChao，SHENLi，LüChang.YuanpeiCollege，ShaoxingUniversity，Shaoxing312000，China

[Key words]Sec-O-Glucosylhamaudol；Macrophage；Inflammation；Nitric oxide；Interleukin-6

中藥防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)[Saposhnikovia divaricata(Turcz)Schisck]的未抽花莖植株的干燥根，臨床常用于感冒頭痛，風(fēng)濕痹痛，風(fēng)疹瘙癢，破傷風(fēng)。藥理學(xué)研究表明，防風(fēng)粗提取物具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗過敏、抗驚厥、抑菌和增強機體非特異性免疫功能的作用[1]。亥茅酚苷(Sec-O-Glucosylhamaudol)是從中藥防風(fēng)中分離純化得到的一個色原酮類化合物，其作為抗炎免疫類中成藥主要成分已有報道[2，3]，然而，國內(nèi)外對亥茅酚苷的抗炎作用研究相對空白。本實驗中，我們建立脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞株(RW264.7)炎癥模型，評估亥茅酚苷的抗炎活性。

1材料與方法

1.1試劑DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco公司，LPS購于美國Sigma公司，總蛋白提取試劑盒、NO檢測試劑盒購于碧云天生物，TRIZOL、Bradford蛋白定量試劑盒、兩步法Realtime-PCR檢測試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Invitrogen公司，小鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒購自北京達科為公司，PCR引物由英韋創(chuàng)津廣州公司合成，兔抗鼠iNOS單克隆抗體、兔抗鼠GAPDH單克隆抗體來源于美國CST公司。

1.2儀器CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Forma Scientific公司)，多功能酶標儀(美國Bio-Rad公司)，電泳儀及轉(zhuǎn)移裝置(美國Bio-Rad公司)，ABI 7500熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3細胞小鼠來源的巨噬細胞株RAW264.7購自中國科學(xué)院上海細胞庫，培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d換液1次。待細胞生長至70%~80%融合度后進行傳代，2～3 d傳代1次。

1.4方法

1.4.1MTT法檢測亥茅酚苷對RAW264.7細胞活力的影響調(diào)整RAW264.7細胞懸液濃度為 1×105ml-1，加入96孔板內(nèi)，每孔100 μl，置 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，之后加入不同濃度亥茅酚苷80 μl，使其終濃度分別為20、40、80 μg/ml，每組設(shè)5復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。加入5 mg/ml MTT溶20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入 150 μl DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標儀上 570 nm處測量各孔的吸光值，計算樣品對細胞的抑制率。

1.4.2亥茅酚苷對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 細胞釋放NO、IL-6的影響取指數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為5×105ml-1，取0.5 ml加于 24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，每孔分別加入20、40、80 μg/ml的亥茅酚苷以及終濃度為1 μg/ml的LPS，置37℃繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。取細胞上清，通過Griess試劑法[4]，酶標儀A540nm檢測細胞培養(yǎng)基中的NO含量；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣品中IL-6含量。

圖1　亥茅酚苷Fig.1　Sec-O-Glucosyhamaudol

1.4.3亥茅酚苷對LPS誘導(dǎo)的iNOS蛋白表達的影響取指數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為5×105ml-1，取0.5 ml加于24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，之后每孔加入20、40、80 μg/ml的亥茅酚苷以及終濃度為1 μg/ml的LPS，置37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。提取細胞總蛋白，用免疫印跡法(Western blot)檢測細胞iNOS的表達。SDS細胞裂解液破碎細胞，將裂解物離心后取上清，Bradford法檢測蛋白濃度，然后進行SDS-PAGE電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)膜，蛋白轉(zhuǎn)膜封閉后，置于抗iNOS的單克隆抗體溶液中，4℃過夜反應(yīng)后，然后將膜置于含辣根過氧化酶標記的抗體溶液中，進行室溫孵育，最后通過ECL化學(xué)發(fā)光法顯影成像，并分析結(jié)果。

1.4.4亥茅酚苷對LPS誘導(dǎo)的iNOS，IL-6 mRNA表達的影響取指數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為1×106ml-1，取1 ml加于12 孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，之后每孔加入20、40、80 μg/ml的亥茅酚苷以及終濃度為1 μg/ml的LPS，置37℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h。用Trizol 試劑提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，從GeneBank中獲得序列，采用NCBI網(wǎng)上primer-blast軟件設(shè)計引物，引物和擴增片段大小見表1，在熒光定量PCR儀上用相應(yīng)的引物、cDNA 等材料按步驟進行擴增，采用2-△△CT相對定量法進行基因表達分析。

2結(jié)果

2.1亥茅酚苷對巨噬細胞細胞活力的影響如表2所示，亥茅酚苷在20~80 μg/ml計量范圍內(nèi)對巨噬細胞活力沒有明顯的影響(差異無統(tǒng)計學(xué)意義)。

表1　iNOS,IL-6以及GAPDH引物序列Tab.1　PCR primer pairs used to amplify iNOS,IL-6 and GAPDH

因此本實驗選取的最大劑量80 μg/ml對巨噬細胞來說是安全的。

2.2亥茅酚苷對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 細胞釋放NO的影響正常狀態(tài)下，巨噬細胞產(chǎn)生NO的量處于基礎(chǔ)水平。在受到LPS刺激時，NO產(chǎn)生顯著增加(與正常組比較，P<0.01)。不同濃度亥茅酚苷孵育RAW264.7巨噬細胞后劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的NO分泌，其抑制率分別為26.87%、41.96%和51.63%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(表3)。

表2　亥茅酚苷對RAW264.7細胞活力的影響(±s，n=5)Tab.2　Effect of Sec-O-Glucosylhamaudol on RAW264.7 cell viability(±s，n=5)

表2　亥茅酚苷對RAW264.7細胞活力的影響(±s，n=5)Tab.2　Effect of Sec-O-Glucosylhamaudol on RAW264.7 cell viability(±s，n=5)

Treatmentgroup(n=5)OD570Control1.721±0.069Sec-O-Glucosylhamaudol(20μg/ml)1.743±0.073Sec-O-Glucosylhamaudol(40μg/ml)1.682±0.101Sec-O-Glucosylhamaudol(80μg/ml)1.587±0.042

2.3亥茅酚苷對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 細胞釋放IL-6的影響如表3所示，亥茅酚苷劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 細胞釋放IL-6，其抑制率分別為23.87%、35.43%和45%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(表3)。

2.4亥茅酚苷對iNOS活性的影響如圖2所示，在正常情況下，巨噬細胞中基本無iNOS的表達，而在LPS的刺激下，iNOS的表達顯著增高，而亥茅酚苷劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞表達iNOS蛋白。

2.5亥茅酚苷對iNOS和IL-6 mRNA表達的影響如表4所示，在正常情況下，巨噬細胞中iNOS、IL-6 mRNA的表達均很少，而經(jīng)過LPS刺激之后，其表達量顯著增高。而亥茅酚苷對其表達具有明顯的抑制，并具有濃度依賴性。亥茅酚苷在20、40、80 μg/ml劑量時對iNOS mRNA表達的抑制率分別為23.62%、42.01%、51.56%，而對IL-6 mRNA表達的抑制率分別為24.7%、39.2%、47.7%。

表3　亥茅酚苷抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細胞產(chǎn)生NO、IL-6(±s，n=3)Tab.3　Sec-O-Glucosylhamaudol inhibited NO and IL-6 production in LPS-induced RAW264.7 cells(±s，n=3)

表3　亥茅酚苷抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細胞產(chǎn)生NO、IL-6(±s，n=3)Tab.3　Sec-O-Glucosylhamaudol inhibited NO and IL-6 production in LPS-induced RAW264.7 cells(±s，n=3)

GroupsNO(μmol/L)Inhibitionrate(%)IL-6(ng/mg)Inhibitionrate(%)Control4.42±0.187-0.032±0.008-LPS1μg/ml18.09±0.2151)-3.032±0.1181)-Sec-O-Glucosylhamaudol(20μg/ml)13.23±0.2052)26.872.316±0.0452)23.87Sec-O-Glucosylhamaudol(40μg/ml)10.50±0.2822)41.961.969±0.0632)35.43Sec-O-Glucosylhamaudol(80μg/ml)8.75±0.1292)51.631.682±0.0642)45

Note：1)P<0.01,significant compared with vehicle-treated control；2)P<0.01,significant compared with LPS alone.

圖2　亥茅酚苷抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細胞iNOS蛋白的表達Fig.2　Sec-O-Glucosylhamaudol inhibited iNOS express-ion in LPS-induced RAW264.7 cells

表4　亥茅酚苷抑制巨噬細胞iNOS、IL-6 mRNA的表達(±s，n=3)Tab.4　Sec-O-Glucosylhamaudol inhibited iNOS,IL-6 mRNA expression in LPS-induced RAW264.7 cells(±s，n=3)

表4　亥茅酚苷抑制巨噬細胞iNOS、IL-6 mRNA的表達(±s，n=3)Tab.4　Sec-O-Glucosylhamaudol inhibited iNOS,IL-6 mRNA expression in LPS-induced RAW264.7 cells(±s，n=3)

GroupsiNOSIL-6Control0.005±0.0020.000±0.000LPS0.1μg/ml1.000±0.0781)1.000±0.0371)Sec-O-Glucosylhamaudol(20μg/ml)0.765±0.0622)0.753±0.0322)Sec-O-Glucosylhamaudol(40μg/ml)0.582±0.0362)0.608±0.0382)Sec-O-Glucosylhamaudol(80μg/ml)0.487±0.0402)0.523±0.0092)

Note：1)P<0.01,significant compared with vehicle-treated control；2)P<0.01,significant compared with LPS alone.

3討論

炎癥是由多細胞參與的復(fù)雜過程，其本質(zhì)是機體應(yīng)對各種損傷性刺激實現(xiàn)自我保護的復(fù)雜防御反應(yīng)，眾多種類的細胞以及活性成分參與了這個過程[5]。而過度的炎癥反應(yīng)則會反過來促使多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，如動脈粥樣硬化、糖尿病、膿毒血癥以及各種類型的關(guān)節(jié)炎等[6]，其中，巨噬細胞是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的重要細胞，也是體內(nèi)啟動炎癥介質(zhì)的中心細胞。脂多糖經(jīng)細菌釋放進入宿主體內(nèi)后通過TLR4受體介導(dǎo)，激活巨噬細胞炎癥信號通路，誘導(dǎo)大量炎癥因子的合成及釋放，如NO、前列腺素PGs等炎癥介質(zhì)以及TNF-α和IL-6等促炎性細胞因子，從而導(dǎo)致機體出現(xiàn)一系列的炎癥反應(yīng)。諸多研究表明，在巨噬細胞內(nèi)，NO主要是在誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)催化下產(chǎn)生，高表達的iNOS 以及過度產(chǎn)生的NO，參與了炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展[7,8]。

中藥的抗炎免疫功效已經(jīng)在臨床治療中得到了廣泛的應(yīng)用，如魚腥草注射液、牛黃解毒片、板藍根、雙黃連等，并且這些藥物的復(fù)方或單體抗炎機理也得到了深入的研究[9-12]。靈芝多糖肽、白芍苷、槐定堿[13-15]等植物提取成分也已經(jīng)在脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥模型上得到了充分的研究，發(fā)現(xiàn)這些化合物對一些炎癥介質(zhì)及促炎因子具有一定的抑制作用，具有潛在的抗炎活性開發(fā)價值。已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)的具有抗炎活性的天然成分種類眾多，分布廣泛，如生物堿、萜類、黃酮、香豆素類、多糖、皂苷、木脂體、鞣質(zhì)以及脂肪族、芳香族化合物等，周家駒等[16]已在《中藥抗炎活性成分》一書中做了系統(tǒng)的闡述。

研究表明，中藥防風(fēng)具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗過敏、抗驚厥、抑菌和增強機體非特異性免疫功能的作用。同為防風(fēng)中色原酮類化合物升麻甙和5-O-甲基維斯阿米醇甙的解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎活性研究已相對成熟[17]。本研究以脂多糖刺激的RAW264.7巨噬細胞為炎癥細胞模型，探討亥茅酚苷對LPS激活的巨噬細胞NO、IL-6的釋放，以及iNOS的表達。結(jié)果顯示，亥茅酚苷在20~80 μg/ml劑量范圍內(nèi)，劑量依賴性地抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細胞產(chǎn)生NO、IL-6，而且對巨噬細胞iNOS蛋白表達也有明顯的抑制作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，亥茅酚苷在轉(zhuǎn)錄水平上對iNOS、IL-6 mRNA有負向調(diào)節(jié)作用。我們的研究顯示亥茅酚苷對LPS誘導(dǎo)的體外炎癥反應(yīng)具有一定的抑制作用，該抑制作用主要表現(xiàn)在其對相應(yīng)炎癥介質(zhì)基因表達的調(diào)控，而其體內(nèi)抗炎活性值得進一步的探討。

參考文獻：

[1]王成章，張崇禧.防風(fēng)國內(nèi)外研究進展[J].人參研究，2008，(1):35-41.

[2]高詠莉.生藥防風(fēng)的化學(xué)成分與藥理作用研究進展[J].山西醫(yī)科大大學(xué)學(xué)報，2004，35(2):216-218.

[3]Shen DD，Xie XJ，Zhu ZJ，etal.Screening active components from Yu-Ping-Feng-San for regulating initiative key factors in allergic sensitization [J]. PloS One，2014，9(9):1-11.

[4]Green LC，Wagner DA，Glogowski J，etal.Analysis of nitrate，nitrite，and [15N]nitrate in biological fluids [J].Anal Biochem，1982，126(1):131-138.

[5]White M.Mediators of inflammation and the inflammatory process[J].J Allergy Clin Immunol，1999，103(3 Pt 2):S378-S381.

[6]Leirisalo-Repo M.The present knowledge of the inflammatory process and the inflammatory mediators[J].Pharmacol Toxicol，1994，75(Suppl 2):1-3.

[7]Cross RK，Wilson KT.Nitric oxide in inflammatory bowel disease[J].Inflamm Bowel Dis，2003，9(3):179-189.

[8]Nagy G，Koncz A，Telarico T，etal.Central role of nitric oxide in the pathogenesis of rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus[J].Arthritis Res Ther，2010，12(3):210-216.

[9]陳婧，方建國，吳方建,等.魚腥草抗炎藥理作用機制的研究進展[J].中草藥，2014，45(2):284-289.

[10]李霞，于慶海，艾明,等.人工培植牛黃抗炎作用及其機制的初步探討[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2000，17(6):431-433.

[11]劉云海，方建國，謝委.板藍根抗內(nèi)毒素機制研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報，2003，34(5):442-447.

[12]高春聯(lián)，苗明三.雙黃連注射液藥理與臨床研究分析[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21(12):3066-3070.

[13]游育紅，林志彬.靈芝多糖肽對小鼠腹腔巨噬細胞一氧化氮產(chǎn)生的影響[J].中國藥理學(xué)通報，2004，20(12):1398-1401.

[14]陳剛，郭莉霞，鄧小紅,等.白芍總苷對巨噬細胞一氧化氮和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶生成的影響及其機制研究[J].中國免疫學(xué)雜志，2008，24(4):345-347.

[15]張巍，李業(yè)成，張高明,等.槐定堿對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞CD14、P38、iNOS表達的影響[J].免疫學(xué)雜志，2015，31(2):100-104.

[16]周家駒，謝桂榮，嚴新建.中藥抗炎活性成分[M].北京:科學(xué)出版社，2012:1-280.

[17]薛寶云，李文，李麗,等.防風(fēng)色原酮甙類成分的藥理活性研究[J].中國中藥雜志，2000，25(5):297-299.

[收稿2015-04-11]

(編輯張曉舟)