毛　敏　張　婷　劉　瀅　賀桂瓊　汪克建

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液內科,重慶430016)

[摘　要]　目的：探討脊髓挫傷、脊髓橫斷及持續(xù)性占位損傷對大鼠繼發(fā)性神經細胞凋亡的影響作用。方法：選取健康雄性Wistar大鼠66只，進行編號后采用隨機數字表法分為A(18只，脊髓挫傷)、B(18只，脊髓橫斷)、C(18只，持續(xù)性占位)、D(6只、假手術組)、E(6只、對照組)五組，分別觀察傷后1、4、7d 各組大鼠的神經細胞凋亡指數、脊髓組織中Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白的表達情況。結果：A、B、C三組大鼠在造模后第1天均出現(xiàn)脊髓灰質和白質染色陽性標記，且三組大鼠的灰質、白質神經細胞凋亡指數差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在造模后第4、7天三組大鼠的灰質、白質區(qū)域脊髓凋亡細胞指數均呈現(xiàn)出增高趨勢(P<0.05)；在造模后第1、4、7天C組大鼠的脊髓灰質、白質區(qū)域凋亡細胞指數顯著高于A組、B組，B組顯著高于A組且差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。造模后第1、4、7天A、B、C、D、E組五組大鼠的Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，造模后第1、4、7天A、B、C 三組大鼠的Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達顯著高于D組和E組(P<0.05)。結論：大鼠脊髓損傷后神經細胞繼發(fā)性凋亡顯著，嚴重程度與損傷類型有關。

[關鍵詞]　脊髓挫傷；脊髓挫傷；持續(xù)性占位損傷；繼發(fā)性神經細胞凋亡

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.005

三種不同脊髓機械性損傷對大鼠繼發(fā)性神經細胞凋亡的影響研究①

毛敏張婷②劉瀅②賀桂瓊②汪克建②

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液內科,重慶430016)

[摘要]目的：探討脊髓挫傷、脊髓橫斷及持續(xù)性占位損傷對大鼠繼發(fā)性神經細胞凋亡的影響作用。方法：選取健康雄性Wistar大鼠66只，進行編號后采用隨機數字表法分為A(18只，脊髓挫傷)、B(18只，脊髓橫斷)、C(18只，持續(xù)性占位)、D(6只、假手術組)、E(6只、對照組)五組，分別觀察傷后1、4、7d 各組大鼠的神經細胞凋亡指數、脊髓組織中Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白的表達情況。結果：A、B、C三組大鼠在造模后第1天均出現(xiàn)脊髓灰質和白質染色陽性標記，且三組大鼠的灰質、白質神經細胞凋亡指數差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在造模后第4、7天三組大鼠的灰質、白質區(qū)域脊髓凋亡細胞指數均呈現(xiàn)出增高趨勢(P<0.05)；在造模后第1、4、7天C組大鼠的脊髓灰質、白質區(qū)域凋亡細胞指數顯著高于A組、B組，B組顯著高于A組且差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。造模后第1、4、7天A、B、C、D、E組五組大鼠的Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，造模后第1、4、7天A、B、C 三組大鼠的Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達顯著高于D組和E組(P<0.05)。結論：大鼠脊髓損傷后神經細胞繼發(fā)性凋亡顯著，嚴重程度與損傷類型有關。

[關鍵詞]脊髓挫傷；脊髓挫傷；持續(xù)性占位損傷；繼發(fā)性神經細胞凋亡

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.005

中圖分類號①本文為重慶市自然科學基金(cstc2011jjA0139)和國家自然科學基金(No.81371221)。;②重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院神經科學研究中心,重慶430016。

作者簡介：毛敏(1982年-)，女，主管護師，主要從事基礎研究和臨床護理工作，同時供職于重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院神經科學研究中心,重慶430016。

通訊作者及指導教師：汪克建(1971年-)，男，博士，主要從事神經生物學、大體解剖學研究，E-mail:wangkejianjj@163.com。

[Abstract]Objective:To study the spinal cord injury,spinal cord transection and persistent placeholder damage on the influence of secondary neural cell apoptosis in rats.Methods: Select 60 healthy male Wistar rats,numbered after using the random number table method is divided into A (18,spinal cord contusion),B (18,spinal cord transection),C (18,continuous placeholder),D (6,control),E (6,the control group only) groups of five,were observed at the 1,4,7 D after 5 group of rats nerve cell apoptosis index,spinal cord tissue Bcl-2,the expression of Bax,caspase 3 protein.Results: A,B,C three groups of rats after building 1 d are gray and white matter positive markers,and the gray matter and white matter of three groups of rats nerve cell apoptosis index differences statistically significant (P<0.05);4 d,7 d after building gray matter and white matter of three groups of rats tend to place increased apoptotic cells in the spinal cord index (P<0.05);in building 1,4,7 d group C after rat spinal cord grey matter and white matter of apoptotic cell index was significantly higher than that of group A and group B,group B were significantly higher in group A and the differences were statistically significant (P<0.05).1,4,7 d after building A,B,C,D,E five group rats the Bcl-2,Bax,caspase-3 protein expression differences were statistically significant (P<0.05),1,4,7 d after building A,B,C the Bcl-2 of three groups of rats,Bax,caspase-3 protein expression was significantly higher than that of group D and group E (P<0.05).Conclusion: Secondary rats after spinal cord injury of nerve cells apoptosis,apoptosis time,severity,and damage type and severity.

Different spinal cord damage on apoptosis of rat secondary impact study

MAOMin，ZHANGTing，LIUYing,HEGui-Qiong,WANGKe-Jian.DepartmentofHematology,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing430016,China

[Key words]Spinal cord contusion;Spinal cord contusion;Persistent placeholder damage;Secondary neural cell apoptosis

脊髓機械性損傷與車禍、墜落、重物砸壓以及工傷有關，發(fā)病患者極易出現(xiàn)下肢體功能障礙，嚴重影響患者健康。已有研究顯示，脊髓機械性損傷后患者存在明顯的神經細胞凋亡情況，這可能是脊髓損傷后繼發(fā)性病理改變的重要機制[1]。細胞凋亡是人體生理活動的重要內容，但如凋亡細胞比例過大或出現(xiàn)凋亡延遲情況，患者脊髓繼發(fā)性損傷將加重。脊髓機械性損傷類型不同，患者臨床癥狀也不同，但患者脊髓細胞凋亡程度是否也不同，臨床尚無統(tǒng)一結論。為此，筆者選取60只健康雄性Wistar大鼠進行了脊髓挫傷、脊髓橫斷及持續(xù)性占位損傷造模，旨在分析三種脊髓機械性損傷對大鼠繼發(fā)性神經細胞凋亡的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物選取健康雄性Wistar大鼠66只，體重250～280 g，平均體重(260±15)g，飼養(yǎng)于室溫25℃、光照12 h的環(huán)境中自由進食進水(華中科技大學同濟醫(yī)學院動物實驗中心提供，動物許可證編號SCX20140016)；進行編號后采用隨機數字表法分為A(18只，脊髓挫傷)、B(18只，脊髓橫斷)、C(18只，持續(xù)性占位)、D(6只、假手術組)、E(6只、對照組)五組。

1.2建立動物損傷模型給予大鼠水合氯醛麻醉后，固定于手術臺，常規(guī)消毒鋪巾，于背部正中切口，咬除T12、T11椎板，暴露脊髓，脊髓挫傷組大鼠選用金屬棒(直徑2.0 mm，重15 g，尾端為球狀)經10 cm引導管自由下滑打擊T12段脊髓3次；脊髓橫斷組大鼠選用弧形刀片將脊髓橫形切斷；持續(xù)性占位組大鼠選用無菌硬質塑料管(直徑為0.5 mm)插入T12段硬膜外間隙，直至椎管后方；假手術組僅行脊髓暴露操作。所有大鼠術后具常規(guī)縫合，并消毒包扎。正常喂食飲水。

1.3取材方法于傷后第1、4、7天水合氯醛麻醉處死大鼠，每次隨機處死6只，記錄大鼠處死時間并以此分組，取出完整脊髓，選用PBS及多聚甲醛溶液固定，將樣本常規(guī)石蠟包埋切片，置于4℃溫箱內待檢。

1.4實驗方法選用原位末端標記法(TUNEL標記)檢測脊髓神經細胞凋亡情況，試劑由Boohringer Mannbein公司提供，將樣本常規(guī)脫蠟、水化后，選用蛋白酶K(上海研域商貿有限公司，CAS號碼：102925-54-2)消化20 min，PBS洗滌，滴入TUNEL反應激孵化60 min，孵化結束后鏡檢，證實陽性結果。選用緩沖液終止反應，滴入AP-anti-Dig稀釋液孵化20 min，BAD染色，核固紅襯染，PBS終止顯色，烤箱烘干，封片，鏡檢。

1.5采用Western blot法檢測Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白將樣本置于12%分離膠內，并選用4%濃縮膠灌膠，電泳，電壓為80 V，轉膜，置于5%脫脂奶粉溶液內，室溫靜置2 h，按1∶500、1∶200、1∶500比例進行Bcl-2、Bax、caspase-3一抗，轉膜與一抗共同孵化，過夜，二抗，TBS-T洗滌，選用ECL化學發(fā)光顯色液進行顯色，攝片，選用Labworks軟件對圖像進行灰度分析。

1.6統(tǒng)計學分析所有統(tǒng)計分析在SPSS17.0統(tǒng)計軟件中進行。計量資料以±s表示，凋亡細胞TUNEL標記呈棕黃色，每張切片隨機選取5個400倍的視野，計數陽性細胞數所占總細胞的百分比(凋亡指數)，多組件比較采用重復測量的方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.15組大鼠的神經細胞凋亡指數比較組織學HE染色顯示E組大鼠(對照組)的脊髓組織灰質和白質界限清楚，灰質內神經細胞體大，核仁清晰，白質內部神經纖維排列緊密有序(圖1A，HE染色×40)；損傷后第1天的C組大鼠脊髓橫斷面可見廣泛出血、脊髓結構被破壞、損傷中心部位可見大量神經細胞溶解死亡，出血壞死區(qū)大量空泡(圖1B，HE染色，×40)；熒光顯微鏡下觀察C組大鼠損傷后第1天，可檢測到較強的綠色熒光信號(圖1C，熒光表達，×100)；C組大鼠在損傷后第1天，TUNEL標記顯示陽性細胞呈棕褐色，分布于脊髓灰質和白質中，白質中累及范圍較廣，可見細胞壞死形成較多的空泡區(qū)域(圖1D，×200，左上角為×40)。

D組和E組的凋亡細胞檢測中，均出現(xiàn)陽性著色，所以表1僅列出三組實驗大鼠的神經細胞凋亡指數數據進行分析；A、B、C三組大鼠在造模后第1天均出現(xiàn)脊髓灰質和白質染色陽性標記，且三組大鼠的灰質、白質神經細胞凋亡指數差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在造模后第 4、7天三組大鼠的灰質、白質區(qū)域脊髓凋亡細胞指數均呈現(xiàn)出增高趨勢(P<0.05)；在造模后第1、4、7天C組大鼠的脊髓灰質、白質區(qū)域凋亡細胞指數顯著高于A組、B組，B組顯著高于A組且差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1　三組大鼠造模后不同時間的神經細胞凋亡指數(%，±s)Tab.1　Apoptotic index of different time of three groups of rats(%,±s)

表1　三組大鼠造模后不同時間的神經細胞凋亡指數(%，±s)Tab.1　Apoptotic index of different time of three groups of rats(%,±s)

GroupsProject1d4d7dAgroup(n=18)GrayMatter4.42±1.122)3)11.30±3.081)2)3)6.51±1.201)2)3)Whitematter4.36±1.092)3)8.61±2.941)2)3)12.37±4.081)2)3)Bgroup(n=18)GrayMatter9.18±2.362)14.17±3.141)2)13.85±2.961)2)Whitematter10.08±4.112)13.53±4.121)2)12.64±3.721)2)Cgroup(n=18)GrayMatter12.07±2.4317.62±3.551)9.17±2.641)Whitematter13.21±2.0616.74±4.131)15.93±3.471)

Note：Compared with the 1 day，1)P<0.05；compared with group C，2)P<0.05；compared with group B，3)P<0.05.

表2　造模后不同時間5組大鼠的Bcl-2蛋白表達(%,±s)Tab.2　Expression of Bcl-2 protein in 5 groups of rats at different time after modeling(%,±s)

表2　造模后不同時間5組大鼠的Bcl-2蛋白表達(%,±s)Tab.2　Expression of Bcl-2 protein in 5 groups of rats at different time after modeling(%,±s)

Groupsn1d4d7dAgroup180.34±0.062)0.51±0.121)2)0.46±0.111)2)Bgroup180.40±0.082)0.62±0.091)2)0.56±0.101)2)Cgroup180.44±0.102)0.68±0.071)2)0.73±0.121)2)Dgroup60.26±0.100.27±0.100.26±0.10Egroup60.23±0.080.23±0.080.23±0.08

Note：Compared with the 1 day，1)P<0.05；compared with group D，E，2)P<0.05.

表3　造模后不同時間5組大鼠的Bax蛋白表達(%，±s)Tab.3　Expression of Bax protein in 5 groups of rats at different time after modeling(%，±s)

表3　造模后不同時間5組大鼠的Bax蛋白表達(%，±s)Tab.3　Expression of Bax protein in 5 groups of rats at different time after modeling(%，±s)

Groupsn1d4d7dAgroup180.72±0.162)1.08±0.211)2)0.97±0.171)2)Bgroup180.87±0.152)1.24±0.261)2)1.15±0.191)2)Cgroup180.98±0.142)1.37±0.191)2)1.35±0.181)2)Dgroup60.51±0.150.51±0.150.51±0.15Egroup60.49±0.130.49±0.130.49±0.13

Note：Compared with the 1 day,1)P<0.05;compared with group D,E，2)P<0.05.

表4　造模后不同時間5組大鼠的caspase-3蛋白表達(%,±s)Tab.1　The expression of caspase-3 protein in the 5 groups of rats at different time after modeling(%,±s)

表4　造模后不同時間5組大鼠的caspase-3蛋白表達(%,±s)Tab.1　The expression of caspase-3 protein in the 5 groups of rats at different time after modeling(%,±s)

Groupsn1d4d7dAgroup180.34±0.082)0.49±0.091)2)0.42±0.071)2)Bgroup180.43±0.112)0.63±0.151)2)0.57±0.151)2)Cgroup180.53±0.132)0.78±0.161)2)0.76±0.151)2)Dgroup60.24±0.070.24±0.070.24±0.07Egroup60.22±0.060.22±0.060.22±0.06

Note：Compared with the 1 day,1)P<0.05;compared with group D,E，2)P<0.05.

2.2造模后不同時間5組實驗大鼠的脊髓組織中Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達情況造模后第1、4、7天A、B、C、D、E組五組大鼠的Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，造模后第1、4、7天A、B、C 三組大鼠的Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達顯著高于D組和E組(P<0.05)；D組和E組大鼠的Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達差異不顯著(P<0.05)。見表2~4。

3討論

細胞凋亡是基因及其他因素調控的組織細胞活性的自我消亡過程，也是細胞生理性自動死亡方式之一[2]。當機體遭受嚴重創(chuàng)傷時，局部組織內細胞將因內外環(huán)境的紊亂而出現(xiàn)病理性細胞凋亡情況，這將誘發(fā)或加重局部組織的繼發(fā)性病理損傷[3]。脊髓損傷后神經凋亡是脊髓病理改變的重要機制，患者凋亡神經細胞越少，脊髓癥狀越輕，修復機會越高，反之亦然[4]。脊髓挫傷、脊髓橫斷及持續(xù)性占位損傷是臨床常見的脊髓機械性損傷類型，為分析該三種機械損傷對脊髓細胞凋亡的影響，我們動物模型模擬三種損傷類型，并對比檢測了大鼠繼發(fā)性病理改變后脊髓神經凋亡情況。

我們研究發(fā)現(xiàn)，A、B、C三組大鼠在造模后第1天均出現(xiàn)脊髓灰質和白質染色陽性標記，且三組大鼠的灰質、白質神經細胞凋亡指數差異具有統(tǒng)計學意義；在造模后第4、7天三組大鼠的灰質、白質區(qū)域脊髓凋亡細胞指數均呈現(xiàn)出增高趨勢 。脊髓挫傷即脊髓撞擊損傷，病理改變與“對沖傷”有關，白質側壁損傷是本類損傷的重要特征[5]。我們的研究中選用金屬棒經引導管自由下滑打擊大鼠T12段脊髓來進行脊髓挫傷造模。同時選用弧形刀片將脊髓橫形切斷以及無菌硬質塑料管插入T12段硬膜外間隙來進行脊髓橫斷及持續(xù)性占位損傷造模。脊髓白質主要由上下縱向連接的傳導纖維構成，這些傳導纖維主要通過神經纖維膠質連接成一體。脊髓白質含有大量的髓神經纖維[6]。脊髓灰質則含有大量的神經元，主要由無髓纖維及少量有髓纖維構成，因此，脊髓損傷后出現(xiàn)的繼發(fā)性脫髓鞘可能是脊髓神經細胞凋亡的重要影響因素。持續(xù)性占位損傷組大鼠凋亡細胞主要集中與背側束區(qū)，這與脊髓挫傷組明顯不同。已有研究證實，脊髓神經細胞凋亡程度與損傷程度、損傷位置有關，還與缺血后再灌注、NO改變、凋亡基因、氧自由基等有關[7]。我們的研究中發(fā)現(xiàn)造模后第1、4、7天C組大鼠的脊髓灰質、白質區(qū)域凋亡細胞指數顯著高于A、B組，而B組顯著高于A組，提示持續(xù)性占位損傷大鼠脊髓神經細胞凋亡數顯著高于其余兩組，這可能與大鼠脊髓病理改變持續(xù)存在有關，神經細胞凋亡誘因一直存在[8]。脊髓橫斷性損傷大鼠存在脊髓解剖結構連續(xù)性喪失情況，大鼠神經遞質、神經營養(yǎng)因子傳遞中斷，這導致大鼠早期存在大量神經細胞凋亡情況。我們發(fā)現(xiàn)B組大鼠的脊髓灰質、白質區(qū)域凋亡細胞指數顯著高于A組，低于C組，這可能與脊髓斷端下側健康下軸突的持續(xù)低頻沖動作用消失、白質、灰質背景張力消失，神經細胞更易凋亡有關。

Bcl-2蛋白是細胞存活促進因子的一種，可阻斷線粒體釋放細胞色素C到細胞質內，進而抑制細胞凋亡。Bax基因歸屬于Bcl-2基因家族，可與Bcl-2構成異二聚體，對Bcl-2具有阻滯效用[9]。caspase-3是機體細胞凋亡過程中的重要蛋白酶，是多種凋亡途徑的下游效應物，也是細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應的必要物質[10]。本次研究結果表明造模后第1、4、7天A、B、C、D、E組五組大鼠的Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達差異均具有統(tǒng)計學意義，造模后第1、4、7天A、B、C 三組大鼠的Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達顯著高于D組和E組，這表明三種損傷模型大鼠存在明顯神經細胞凋亡情況，提示造模成功。

綜上所述，大鼠脊髓損傷后神經細胞繼發(fā)性凋亡時間、凋亡程度與損傷類型、損傷嚴重程度相關，提示在脊髓急性損傷后，臨床需根據患者損傷類型、損傷嚴重程度來確定最佳治療時間及方案，以提高修復成功率。

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[收稿2015-02-05修回2015-03-07]

(編輯許四平)