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·針推經(jīng)絡(luò)·

針刺對腦缺血再灌注大鼠相關(guān)miRNA數(shù)目的影響

陳文，林亞平，楊茜蕓，劉琴，肖姮，田浩梅*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南長沙410208）

〔摘要〕目的觀察針刺療法對腦缺血再灌注大鼠相關(guān)miRNA數(shù)目的影響。方法參照ZeaLonga線拴法復(fù)制大腦中動脈缺血模型(MCAO)并加以改良，將40只SD大鼠隨機分為空白組、假手術(shù)組、模型組、針刺組，治療72h后，用基因微陣列技術(shù)篩選差異表達miRNA，并對神經(jīng)功能缺損評分、TTC染色檢測的梗死面積比進行比較。結(jié)果與空白組及假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分，梗死面積比增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；針刺治療組相對應(yīng)指標則不同程度地降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與空白組比較，模型組有4個差異基因表達；與假手術(shù)相比，模型組有5個差異基因表達；與模型組相比，針刺組有個16差異基因表達；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論針刺療法可改善神經(jīng)功能缺損，減少腦梗死面積及細胞凋亡，對腦組織起保護作用，其機制可能與針刺療法調(diào)節(jié)相關(guān)的miRNA有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕針刺；腦缺血再灌注損傷；miRNA

Effects of Acupuncture on the Number of miRNA in Cerebral Ischemia Reperfusion Rats

CHEN Wen，LIN Yaping，YANG Qianyun, LIU Qin，XIAO Heng，TIAN Haomei*

(Acupuncture and Massage College of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China)

〔Abstract〕Objective To observe the effect of acupuncture therapy on the number of miRNA in cerebral ischemia reperfusion rats. Methods Focal cerebral ischemia model was prepared with modified ZeaLonga' suture method. 40rats were randomly divided into 4groups，the blank group,the model group,the sham operation group,the acupuncture group,10in each group．After 72h treatment, the number of RNA express wasdetected with gene chip technology. The neurological function defect score and infarct size were compared. Results Compared with the blank group and sham operated group, the neurological deficit score and infarct area in the model group were significantly increased, the difference was statistically significant (P <0.05). The relative indexes of the acupuncture treatment group were decreased, and the difference was statistically significant (P<0.05). Compared with the blank group, there were 4differential gene expressions in the model group, compared with the sham operation, the model group had 5different gene expressions. Compared with the model group, the acupuncture group had a 16difference genes expression, the difference was statistically significant (P<0.05). Conclusion Acupuncture theapy can improve the neurological deficit, reduce the area of cerebral infarction and cell apoptosis, protect brain tissue, and its mechanism may be related to the regulation of related miRNA.

〔Keywords〕acupuncture; cerebral ischemia reperfusion injury; miRNA

腦缺血損傷主要有兩類，缺血的原發(fā)性損傷與再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷是指腦缺血致腦細胞損傷，恢復(fù)血液再灌注后，其缺血性損傷反而進一步加重的現(xiàn)象，是腦血管疾病發(fā)病的主要部分，且有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點。其過程包含一系列復(fù)雜的病理生理變化，機制極其復(fù)雜[1-2]。缺血期發(fā)生的病理生理變化并不是完全定型和不可逆的，血液恢復(fù)灌流后形成內(nèi)源性損傷因子，啟動一系列的病理生理過程導(dǎo)致腦缺血損傷進一步加重，即存在“缺血再灌注損傷”機制[3]，這種損傷是腦血管疾病發(fā)病的主要原因。

腦缺血再灌注損傷機制極為復(fù)雜，許多基因的表達發(fā)生明顯變化，某些蛋白的表達顯著上調(diào)[4]。近年研究認為，MicroRNA（miRNA）可能同樣參與了腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展，許多研究顯示，在腦缺血再灌注后，有許多miRNA發(fā)生了變化[5-6]，而且Shup-ing Xiao[7]對腦缺血的相關(guān)miRNAs進行協(xié)同網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)各個miRNAs有不同高度的相關(guān)性。

針刺療法治療腦缺血再灌注損傷療效確切，但具體機制仍在進一步研究，本研究觀察針刺治療CIRI大鼠72h后的腦組織miRNA的表達譜變化，探討針刺對腦缺血再灌注損傷的相關(guān)miRNA數(shù)目的影響。

1　材料與方法

1.1動物

SD健康雄性大鼠40只，清潔級，體質(zhì)量（265± 15）g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。許可證號SCXK(湘)2013-0004。

1.2試劑與儀器

10%水合氯醛（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）(WB1001,維爾生物科技有限公司)；1.5% 2，3，5-苯氯化四氮唑（TTC）溶液（C19H15,維爾生物科技有限公司）；4%多聚甲醛(WB0401，維爾生物科技有限公司)。

Shandon325型石蠟切片機（英國Shandon公司），MIAS醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)（北航公司），LEICA DM LB2型雙目顯微鏡(德國LEICA公司)，雙極電凝器（上海醫(yī)用激光儀器），HHS-2電子恒溫不銹鋼水浴鍋(上海南陽儀器有限公司)，腦槽、數(shù)位溫度表（TES 1310TYPE-K），大鼠肛溫溫度計(JNT)。微循環(huán)泵（Atactic Technologies公司），激光掃描儀（GenePix 4000B，Molecular Device），Array-Pro圖像分析軟件（Media Cybernetics）。

1.3動物分組及造模

40只大鼠隨機分為空白組、假手術(shù)組、模型組、針刺組，每組10只?？瞻捉M不予造模。模型組、針刺組參照ZeaLonga[8]線拴法復(fù)制大腦中動脈缺血模型(MCAO)并加以改良，以10%水合氯醛0.3mL/kg腹腔麻醉，頸正中切口，暴露頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)及頸內(nèi)動脈（ICA），電凝交通動脈，結(jié)扎ECA后電凝，動脈夾夾閉CCA與ICA，在頸外剪一斜形小口，將0.28mm單絲尼龍魚線頭端5mm用石蠟包被，并于18mm長度處標記，從切口處插入，栓線長度自CCA分叉處約18～20mm（根據(jù)動物體質(zhì)量而定），栓塞右側(cè)大腦中動脈，局部噴灑青霉素注射液防止感染，然后縫合皮膚，栓線尾端部分固定于皮膚上。缺血2h后小心抽出栓線，即形成再灌注模型。假手術(shù)組僅插入尼龍魚線約10mm，不栓塞，其余步驟同手術(shù)組。

1.4造模后評分標準及入組標準

神經(jīng)功能缺損評分標準[8]：0分，無神經(jīng)功能損傷癥狀；1分，提尾時栓塞動脈對側(cè)前肢不能伸直；2分，行走時向栓塞動脈對側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分，行走時向栓塞動脈對側(cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。各組大鼠于缺血再灌注2h時進行神經(jīng)功能評分，剔除評分為0分和4分的大鼠，評分1-3分者入組。治療72h后各組大鼠再進行一次神經(jīng)功能評分。

1.5干預(yù)方法

空白組不做其它任何處理，其余各組待大鼠呼吸、心跳等生命體征穩(wěn)定（造模后3h）以后，假手術(shù)組、模型組只捆綁不針刺；針刺組針刺相應(yīng)穴位后捻轉(zhuǎn)1min，15min后捻轉(zhuǎn)1次，留針30min，12h/次，共治療7次（療程72h）。取穴標準參照《實驗針灸學(xué)》及華興邦制定的《實驗動物圖譜》，并模擬人體腧穴骨度分寸法量取。人中：唇裂鼻尖下1mm正中處。直刺1～2mm。百會：頂骨正中，平刺2mm。大椎：第7頸椎與第1胸椎間，背部正中，直刺3mm。

1.6TTC染色測梗死面積

治療72h后，每組隨機抽取5只大鼠，大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉,迅速斷頭取腦,用冰生理鹽水沖洗后，迅速放入-20℃冰箱內(nèi)冷凍15min左右,去掉嗅球、小腦和低位腦干，冠狀切四刀,切成五片,第一刀在腦前極與視交叉連線中點處；第二刀在視交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間。然后迅速將切片置于1.5%氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液中（37℃）避光孵育15～30min，每隔5min翻動1次。染好色后，將其置于10%甲醛中固定。

1.7microRNA表達譜的檢測

治療72h后，每組隨機抽取3只大鼠,微陣列實驗由LC Sciences公司進行。微陣列實驗使用4～ 8μg總RNA樣品。使用Poly(A)聚合酶在總RNA 3'端加上poly(A)尾巴，再將一個寡聚核苷酸標記與這個poly(A)尾巴連接（ligation）用于后續(xù)的熒光標記。雜交反應(yīng)利用微循環(huán)泵（Atactic Technologies）的循環(huán)作用在μParaflo微流體芯片上過夜進行[9-10]。在微流體芯片上，每條檢測探針都是由一個化學(xué)修飾核苷酸編碼段[與目標microRNA互補（來源于miRBase，http://www.mirbase.org/）或是與其他RNA（質(zhì)控或是客戶定制序列）互補]和一個由聚乙二醇組成的間隔段（擴大編碼段與基質(zhì)的間距）組成。檢測探針均使用PGR（photogenerated reagent）化學(xué)法進行原位合成。雜交解鏈溫度是通過化學(xué)修飾檢測探針進行平衡。雜交使用含有25%甲酰胺的100μL 6xSSPE緩沖液[0.90M氯化鈉（NaCl），60mM磷酸氫二鈉（Na2HPO4），6mM乙二胺四乙酸（EDTA），pH 6.8]，雜交溫度為34℃。RNA與探針雜交后，與標記特異結(jié)合的Cy3染料在微流體芯片上循環(huán)流動進行染色。利用激光掃描儀采集雜交圖像并使用Array-Pro圖像分析軟件進行圖像數(shù)字化轉(zhuǎn)換。數(shù)據(jù)分析首先是減除背景值，然后使用LOWESS過濾[11]（局部加權(quán)回歸）進行信號歸一化。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計，行正態(tài)性、方差齊性檢驗；滿足正態(tài)性、方差齊采用單因素方差分析，LSD法進行兩兩比較；方差不齊采用Tamhane T2法進行兩兩比較。不滿足正態(tài)性及方差齊者，用非參數(shù)檢驗,所有實驗數(shù)據(jù)均用“±s”表示。P<0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1針刺對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評分的影響

針刺組治療后比治療前神經(jīng)功能評分降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05),治療后,與空白組及假手術(shù)組比較，模型組、針刺組神經(jīng)功能評分較高，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），與模型組比較，針刺組能降低神經(jīng)功能評分,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05），如表1所示。

表1　針刺對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評分的影響(±s）

表1　針刺對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評分的影響(±s）

注：與針刺組治療前比較葒P<0.05；與空白組比較**P<0.01；與假手術(shù)組比較##P<0.01；與模型組相比&P<0.05。

組別空白組假手術(shù)組模型組針刺組n 10101010再灌2h后0.00±0.0000.00±0.0001.50±0.527**##1.40±0.516**##治療72h后0.00±0.0000.00±0.0001.50±0.527**##0.80±0.422葒**##&

2.2針刺對腦缺血再灌注大鼠腦梗死面積的影響

與空白組及假手術(shù)組比較，模型組、針刺組梗死面積比均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），即成模后各組都出現(xiàn)神經(jīng)細胞損傷；與模型組比較,針刺組梗死面積比減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05）。如表2所示。

表2　針刺對腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)梗死面積比的影響(±s）

表2　針刺對腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)梗死面積比的影響(±s）

注：與空白組比較**P<0.01；與假手術(shù)組比較##P<0.01；與模型組比較&P<0.05。

組別n 腦梗死面積比空白組假手術(shù)組模型組針刺組55550.00±0.000.00±0.0033.43±5.64**##18.39±10.86**##&

大鼠腦組織切片經(jīng)TTC染色后,紅色為正常腦組織，白色為梗死區(qū)域?？瞻捉M和假手術(shù)組未見梗死灶,模型組可見大片白色梗死灶,證明造模成功，針刺組可見小片白色梗死灶。如圖1所示，藍色箭頭所指為梗死灶。

圖1　各組大鼠梗死面積TTC染色圖

2.3針刺對腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)海馬組織miRNA表達譜的影響

差異基因(miRNA)的篩選：每組選擇三個樣本按隨機方差模型進行兩組樣本間差異的篩選，利用隨機方差模型計算每個基因(miRNA)的顯著性水平(P值)，按照P<0.05進行篩選，獲得差異表達的miRNA。我們在兩組之間共發(fā)現(xiàn)32個差異miRNA，與空白組相比，模型組有4個差異基因，針刺組有5個差異基因；與假手術(shù)組相比，模型組有5個差異基因，針刺組有仍7個差異基因；與模型組相比，針刺組有16個差異基因；造模后有9個基因差異表達，針刺治療后，有21個差異表達基因。差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

雖然在兩組之間有眾多的差異基因(miRNA)被發(fā)現(xiàn)，但并不是所有這些差異基因(miRNA)均參與疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。其中有些與腦缺血再灌注損傷密切相關(guān)，需要我們進一步驗證。

3　討論

miRNA是一類高度保守的長約19～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，其種類眾多，表達具有一定的組織特異性。miRNA在細胞生長和發(fā)育過程的調(diào)節(jié)過程中起多種作用。在細胞增殖、分化、凋亡、死亡等生理病理過程中，miRNAs的調(diào)節(jié)作用不容忽視。督脈屬奇經(jīng)八脈之一，是人體諸陽經(jīng)脈總匯，對整個經(jīng)脈系統(tǒng)有統(tǒng)帥作用，因此督脈與腦、脊髓等關(guān)系密切，故歷代醫(yī)家認為“病變在腦，首取督脈”。且課題前期研究表明：針刺百會、大椎、人中治療72h能改善大腦中動脈閉塞后2h再灌注模型大鼠神經(jīng)功能缺損、減少腦梗死面積等作用，從而對腦產(chǎn)生保護作用[12]，且其保護作用的實現(xiàn)為多途徑、多靶點與多條信號的調(diào)整[13]。

近年研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注后，有許多miR-NA發(fā)生了變化[5-6]，我們的研究發(fā)現(xiàn)，造模后，激活了9個差異表達基因，可能腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致這些基因的差異表達，也可能是這些基因表達，通過促進神經(jīng)細胞凋亡、激活某些通路、促進炎癥水腫等加重腦細胞的損傷，針刺治療后，共激活了21個差異表達基因。與造模后激活的差異基因有2個重復(fù)，重復(fù)的rno-miR-331-3p、rno-let-7d-5p我們在GO基因功能中發(fā)現(xiàn)，它們既能促進也能抑制細胞的凋亡，對腦缺血再灌注損傷的多方面都具有雙向調(diào)節(jié)作用，可能針刺療法能刺激以上這些miRNA，逆轉(zhuǎn)有害的影響，保護腦組織。

表3　各組間差異基因表達（P<0.05）的數(shù)目及名稱

也有研究認為[14]，造模后miRNA 290、miRNA 494會明顯降低，針刺預(yù)處理能使其顯著提高，本實驗各組間比較中，沒有一組出現(xiàn)miRNA 290、miRNA 494，這可能與不同研究者采用的動物模型、觀察時間不同以及治療手段的不同有關(guān),可能還需要大量實驗對腦缺血損傷的治療方式、損傷變化做進一步的研究，使臨床治療更具靶向性。

針刺治療缺血性腦損傷已被大量臨床與實驗所驗證，證明針刺對腦缺血后的神經(jīng)元具有保護作用，可以減輕腦水腫，減少梗死面積。我們驗結(jié)果顯示，造模成功后大鼠神經(jīng)功能評分增加，梗死面積明顯，針刺療法能改善腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損、降低腦梗死面積。其療效可能與針刺激活的21個差異基因的功能有關(guān)。本實驗只做了一個廣泛的篩選，各miRNA的功能、具體調(diào)控靶蛋白及其涉及的精準調(diào)控機制、相互之間的關(guān)聯(lián)等還需進一步研究。

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（本文編輯匡靜之）

〔通訊作者〕*田浩梅，女，副教授，E-mail：451358104@qq.com。

〔作者簡介〕陳文，女，在讀碩士研究生，研究方向：經(jīng)脈-臟腑相關(guān)。

〔基金項目〕國家自然科學(xué)基金青年基金項目資助(81303051)；湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目（201471）。

〔收稿日期〕2015－09－24

〔中圖分類號〕R245.3

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2015.11.017