陳錫劍，陳建華

(中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇 南京 210009)

常壓室溫等離子體誘變選育高產曲酸米曲霉

陳錫劍，陳建華

(中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇 南京 210009)

摘要：以米曲霉KA2308作為出發(fā)菌株，首次利用常壓室溫等離子體誘變技術選育高產曲酸菌株，通過96孔板高通量篩選獲得一株曲酸生產菌KA1515，曲酸產量提高到47.28 g·L-1，比出發(fā)菌株提高了31.48%，經過多次傳代，曲酸產量仍比較穩(wěn)定。表明采用常壓室溫等離子體誘變能有效提高米曲霉曲酸產量。

關鍵詞：米曲霉；曲酸；常壓室溫等離子體誘變；突變株；高通量篩選

曲酸(kojic acid)是微生物有氧發(fā)酵產生的一種有機酸，具有抑制酪氨酸酶的作用[1-2]及抗菌活性[3-4]，因此被廣泛用作食品防腐劑、保鮮護色劑[5-6]及美白添加劑[7]。微生物發(fā)酵是曲酸工業(yè)化生產的主要途徑，由于曲酸是微生物代謝的次級產物，其合成過程較復雜，合成機制至今仍不清楚，因此，應用基因工程的方法提高曲酸產量仍有困難。目前，誘變育種提高發(fā)酵菌種的產酸量仍是研究的重點。

多年來，學者們通過運用多種不同的誘變方法進行曲酸生產菌株的選育，獲得了一些曲酸高產菌株，但誘變方法仍以傳統(tǒng)的物理誘變(如紫外誘變[8])和化學誘變(如EMS[9])居多。傳統(tǒng)的物理誘變回復突變嚴重，而化學誘變的誘變劑多數(shù)有強致癌性，存在安全隱患。雖然近年來出現(xiàn)了一些新的誘變手段，如60Co[10]、N+離子注入[11]，但這類方法普遍設備昂貴，不易操作，因此應用范圍有限。常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)生物誘變育種技術是一種新型的誘變手段，具有射流溫度低、產生的等離子體均勻、無需真空裝置、操作簡單、成本低、與生物大分子和細胞作用明顯等優(yōu)點[12]。目前已應用于酵母[13]、大腸桿菌[14]及刺糖多孢菌[15]等多種微生物誘變選育并取得良好效果，但尚未有利用ARTP誘變選育曲酸生產菌株米曲霉的報道。作者首次利用ARTP誘變育種儀對本實驗室選育保藏的米曲霉KA2308進行誘變，并通過96孔板進行高通量篩選，得到一株較為穩(wěn)定的曲酸高產菌株。

1實驗

1.1　菌種與培養(yǎng)基

米曲霉(Aspergillusoryzae)KA2308，本實驗室選育保藏。

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：自制麥芽汁 6°Bé，瓊脂2%。

初篩培養(yǎng)基：葡萄糖 10%，酵母膏 0.25%，KH2PO40.1%，KCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH值自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 10%，酵母膏 0.4%，K2HPO40.01%，MgSO4·7H2O 0.02%，pH值6.0。

1.2　試劑與儀器

曲酸，Sigma公司；瓊脂粉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸、鹽酸，南京化學試劑有限公司；葡萄糖，國藥集團化學試劑有限公司；硫酸鎂，上海美興化工股份有限公司；酵母膏，江山生物試劑有限公司。

ARTP-Ⅱ型誘變育種儀，無錫源清天木生物科技有限公司；PHS-25型pH測量儀，上海雷磁儀器廠；搖床，上海智誠分析儀器制造有限公司；TGL-16型臺式高速離心機，金壇科析儀器有限公司；722S型可見分光光度計，上海棱光技術有限公司；GHX-9080B-1型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海?，攲嶒炘O備有限公司。

1.3　出發(fā)菌株的篩選

將米曲霉KA2308活化，挑取27株單菌落，用搖瓶發(fā)酵后，取上清液用三氯化鐵比色法選出曲酸產量最高的菌株，作為誘變的出發(fā)菌株。

1.4　菌種誘變

1.4.1孢子懸浮液的制備

取培養(yǎng)5 d的斜面，用生理鹽水洗下孢子，將孢子打散后過濾得到孢子懸浮液，用血細胞計數(shù)板計數(shù)，調節(jié)孢子數(shù)約為106個·mL-1。

1.4.2ARTP誘變

將孢子懸浮液適當稀釋后，在誘變育種儀上進行誘變，誘變時間分別為100 s、120 s、140 s、160 s、180 s、200 s，處理0 s作為對照，處理結束后用生理鹽水進行洗脫，適當稀釋后取100μL涂平板，30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d。

1.4.3高通量篩選方法

挑取單菌落于30 ℃斜面培養(yǎng)3 d，在96孔板中加入200μL初篩培養(yǎng)基，取適量菌絲至孔中，30 ℃培養(yǎng)3 d后取適量培養(yǎng)液至另一96孔板中，加1滴FeCl3溶液顯色，適當稀釋后用酶標儀測OD500值。

1.4.4搖瓶復篩

將一環(huán)初篩較高的菌株的孢子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行復篩，培養(yǎng)條件：500 mL 錐形瓶裝液量40 mL，搖床轉速200 r·min-1，30 ℃發(fā)酵5 d。

1.4.5突變株的遺傳穩(wěn)定性考察

通過5次菌種傳代，并測定曲酸產量，考察突變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.5　測定方法[16]

1.5.1曲酸標準曲線的繪制

1)顯色劑的配制

稱取10 g FeCl3，加入22.5 mL濃鹽酸，用蒸餾水定容到1 000 mL。

2)標準曲線的繪制

準確稱取曲酸標準品0.1000 g，溶于蒸餾水中，定容至100 mL，用吸管分別吸取0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL標準品樣液于10個100 mL容量瓶中，分別加入顯色劑2 mL，定容至100 mL，得到濃度分別為0.000 g·L-1、1.000 g·L-1、2.000 g·L-1、3.000 g·L-1、4.000 g·L-1、5.000 g·L-1、6.000 g·L-1、7.000 g·L-1、8.000 g·L-1、9.000 g·L-1的標準溶液，在波長500 nm下分別測定吸光度(OD500)，繪制標準曲線。

1.5.2發(fā)酵液中曲酸含量的測定

發(fā)酵液適當稀釋后，取1 mL稀釋液至100 mL容量瓶中，加入2 mL顯色劑，蒸餾水定容至100 mL，500 nm下測定吸光度，由線性回歸方程計算得曲酸濃度，乘以稀釋倍數(shù)后即得發(fā)酵液中曲酸含量。

2結果與討論

2.1　曲酸標準曲線

曲酸能和0.1×10-6的Fe3+不可逆反應生成紅色絡合物，該絡合物在500 nm波長處有吸收峰，且在一定范圍內，曲酸濃度與OD500值呈正比。三氯化鐵比色法較為靈敏，廣泛用于曲酸含量測定[11,17-18]。

以曲酸標準溶液濃度為橫坐標、OD500值為縱坐標，繪制標準曲線，結果如圖1所示。

圖1　曲酸標準曲線Fig.1　Standard curve of kojic acid

由圖1擬合得線性回歸方程為:y=0.832x+0.0096，式中y為OD500值，x為樣品中曲酸濃度(g·L-1)，R2=0.9993。

2.2　出發(fā)菌株的篩選結果

將本實驗室保藏的米曲霉菌種活化后得到27個單菌落，對這27株菌進行篩選，結果如圖2所示。

圖2　出發(fā)菌株選育結果Fig.2　The breeding results of original strain

由圖2可知，編號為KA2308-11菌株產酸最高，故選定KA2308-11菌株為誘變出發(fā)菌株，原始產酸量為35.96 g·L-1。

2.3　ARTP誘變致死率及選育結果

由于米曲霉的孢子具有較厚的孢子壁，需要較長的處理時間。ARTP誘變選育的致死率曲線見圖3。

圖3　ARTP誘變致死率曲線Fig.3　The lethal rate curve of ARTP

由圖3可知，對米曲霉的孢子誘變處理時間為100~200 s。隨著誘變時間的延長，菌體的致死率不斷上升；處理100~180 s的致死率差別不大，均在90%左右；但當處理200 s時，致死率明顯提高到99.61%。因此，選擇誘變處理時間為200 s。

2.4　高產曲酸菌株的篩選

由于高產菌株曲酸產量較高，與FeCl3反應后顏色較深，可適當稀釋后借助酶標儀測定其OD500值來篩選。本實驗用96孔板法初篩得到5株高產菌株，將這5株菌搖瓶發(fā)酵進行復篩，最終得到一株曲酸產量達到47.28 g·L-1的高產菌株KA1515，產酸能力比出發(fā)菌株提高了31.48%。

2.5　突變株的遺傳穩(wěn)定性

為了考察曲酸高產菌株KA1515的遺傳穩(wěn)定性，進行了菌種傳代實驗，結果如圖4所示。

圖4　KA1515菌株斜面?zhèn)鞔€(wěn)定性Fig.4　Genetic stability of the strain KA1515 on slant culture

由圖4可知，KA1515在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下，連續(xù)傳代5次，曲酸產量均維持在47 g·L-1左右，表明突變株KA1515遺傳性能穩(wěn)定，具有一定工業(yè)生產潛力和應用價值。

2.6　討論

經典的誘變育種造成微生物遺傳性狀的改變是隨機的，篩選工作費時費力，如何在大量的隨機突變中快速篩選出目標菌株，成為制約誘變育種的瓶頸。三氯化鐵比色法是測定曲酸含量的常規(guī)方法，但該法較為繁瑣且耗時、耗力，難以實現(xiàn)菌株的高通量篩選。多種發(fā)酵技術可用于曲酸發(fā)酵，如深層發(fā)酵、固態(tài)和表面培養(yǎng)、分批發(fā)酵培養(yǎng)、分批補料發(fā)酵培養(yǎng)、連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)等。表面靜置培養(yǎng)是指讓霉菌在沒有任何攪拌或振蕩的固體或液體培養(yǎng)基上生長的技術，96孔板靜置培養(yǎng)結合三氯化鐵顯色反應能夠定性地篩選出曲酸正突變株，操作簡單，適合大批量篩選，大大提高了篩選效率，是一種可靠的高通量初篩方法。

3結論

以米曲霉KA2308為出發(fā)菌株，采用新型的ARTP誘變手段進行誘變，得到一株曲酸產量為47.28 g·L-1的高產菌株，產酸能力比出發(fā)菌株提高了31.48%，且該菌株產酸性能較為穩(wěn)定，說明ARTP誘變育種是有效可行的提高曲酸產量的育種手段。

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Mutation ofAspergillusOryzaeby Atmospheric and Room Temperature Plasma for Improving Kojic Acid Production

CHEN Xi-jian，CHEN Jian-hua

(SchoolofLifeScience&Technology,ChinaPharmaceuticalUniversity，Nanjing210009，China)

Abstract：The strain of Aspergillus oryzae KA2308 was exposed on atmospheric and room temperature plasma(ARTP) jet to improve kojic acid production for the first time．A high kojic acid-producing strain KA1515 was obtained by high-throughput screening method with 96-well plates.The yield of kojic acid of mutant reached up to 47.28 g·L-1,increasing by 31.48% compared with original strain.Kojic acid yield was stable after several passages.The results showed that mutation by atmospheric and room temperature plasma could raise kojic acid yield of Aspergillus oryzae effectively.

Keywords：Aspergillus oryzae；kojic acid；atmospheric and room temperature plasma(ARTP)；mutant strain；high-throughput screening

中圖分類號：TQ 921.7

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2015)05-0052-03

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2015.05.013

收稿日期：2015-02-01

作者簡介：陳錫劍(1988-)，女，河北唐山人，碩士研究生，研究方向：生物轉化；

通訊作者：陳建華，教授，E-mail:chenjhnj@163.com。