周晏丞，曹立亭，陳 露，馬 躍

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌 402460）

20世紀(jì)90年代誕生了一種新興的科學(xué)技術(shù)，它利用人工合成的大容量隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)與靶分子在體外的相互作用，篩選出一種與傳統(tǒng)抗體相比特異性更強(qiáng)、親和力更大、性質(zhì)更穩(wěn)定以及制備更容易，無(wú)免疫原抗性，無(wú)批間差異的適配子[1]，該技術(shù)稱(chēng)之為指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）。SELEX技術(shù)打破了傳統(tǒng)的核苷酸配對(duì)的思想，稱(chēng)得上是核酸研究與應(yīng)用領(lǐng)域的里程碑式進(jìn)步。其原理是利用大容量的隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫(kù)進(jìn)行體外多輪篩選、擴(kuò)增，并最終獲得與非核酸靶分子高親和力、高特異性結(jié)合的寡核苷酸序列[2]。SELEX技術(shù)篩選出的適配子不僅分子量小、配體廣泛、體外篩選不依賴(lài)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，甚至可以進(jìn)行多種修飾，比如最為普遍的糖環(huán)修飾、堿基修飾和磷酸修飾等[3]，這些優(yōu)勢(shì)使得SELEX技術(shù)有望成為實(shí)驗(yàn)室和臨床診斷、治療的主要技術(shù)之一。

隨機(jī)寡核苷酸是SELEX篩選技術(shù)的基礎(chǔ)，而隨機(jī)寡核苷酸鏈中間存在一段隨機(jī)序列，由于該隨機(jī)區(qū)的存在使文庫(kù)中的核酸序列極為豐富，給篩選過(guò)程中文庫(kù)的PCR擴(kuò)增帶來(lái)了一系列問(wèn)題，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增[4]得不到理想的隨機(jī)ssDNA，而常規(guī)的試劑盒回收方法對(duì)小片段分子回收效率極低，影響整個(gè)篩選過(guò)程。針對(duì)上述問(wèn)題，本試驗(yàn)在對(duì)稱(chēng)PCR最佳優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上對(duì)隨機(jī)ssDNA文庫(kù)的不對(duì)稱(chēng)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，并且比較了PCR產(chǎn)物不同純化方法的回收效率，以期為SELEX技術(shù)中構(gòu)建亞文庫(kù)以及篩選特異性更強(qiáng)的適配子奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 隨機(jī)ssDNA文庫(kù)：構(gòu)建長(zhǎng)度為80nt的隨機(jī)ssDNA文庫(kù)，ssDNA文庫(kù)序列：5′-CTGGAGCG TCCTGGGGCGTCN（40）GTGCCCTCGCTCCGACCAGC-3′，兩端為固定序列，中間 N（40）為隨機(jī)序列。

PCR擴(kuò)增引物：上游引物5′-CTGGAGCGTCCTG GGGCGTC-3′，下游引物 5′-GCTGGTCGGAGCGAGG GCAC-3′。隨機(jī)文庫(kù)及引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 MgCl2、Taq DNA Polymerase、dNTP、10×PCR Buffer，均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。其他試劑：異丙醇、4mol/L醋酸銨、70%乙醇、酚/氯仿（1∶1）、3mol/L 醋酸鈉、無(wú)水乙醇。

1.2 方法

1.2.1 隨機(jī)ssDNA文庫(kù)與合成引物的質(zhì)量鑒定 將設(shè)計(jì)好的引物和ssDNA文庫(kù)交給上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。合成的引物序列和隨機(jī)ssDNA文庫(kù)采用4%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量鑒定。

1.2.2 不對(duì)稱(chēng)PCR條件優(yōu)化 在前期隨機(jī)ssDNA文庫(kù)對(duì)稱(chēng)PCR反應(yīng)體系[5]優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，參照文獻(xiàn)[6]報(bào)道的方法對(duì)隨機(jī)ssDNA文庫(kù)的不對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行優(yōu)化，擬定的反應(yīng)體系及循環(huán)條件如下：

（1）反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.0 μL，25 mM MgCl22.5mmol/L，dNTP Mixture 0.25mmol/L，上游引物12μmol/L，下游引物 0.6μmol/L，Taq DNA Polymerase 1.5U，ssDNA模板2.5ng，無(wú)菌水補(bǔ)至20μL。

（2）循環(huán)條件：94℃預(yù)變性 30 s，94℃變性 30 s，68℃退火30s，共20個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸15s，72℃溫育7min。

其他反應(yīng)組分與反應(yīng)條件相同，固定下游引物投入量（0.6 μmol/L），以不同上、下游引物比例（1∶1、20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1） 分別擴(kuò)增 20、30 個(gè)熱循環(huán)次數(shù)，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)以驗(yàn)證其穩(wěn)定性。

（3）產(chǎn)物鑒定：PCR產(chǎn)物采用4%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 PCR產(chǎn)物回收 以1.2.2中確立的最佳循環(huán)次數(shù)和上下游引物比例進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別采用下列3種方法進(jìn)行回收純化試驗(yàn)，比較其回收效率。

（1）商品化試劑盒提取法：4%瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，待片段完全分離后，在紫外光下切取所需條帶，DNA在紫外燈下曝光時(shí)間不超過(guò)30s，準(zhǔn)確稱(chēng)取凝膠塊的重量，按照1g/mL Binding Buffer對(duì)應(yīng)量，加入適量體積的Binding Buffer，55～60℃水浴溶解（約 7～10min），每隔 2～3min振蕩一次。溶解完成后，將DNA/凝膠混合液轉(zhuǎn)移到套有收集管的HiBind DNA 柱子上，10000×g離心1min，倒去濾液，把柱子裝回收集管；加入300μL Bind Buffer，按上述條件離心，棄去濾液，再把柱子重新裝回收集管；加入700μL SPW Wash Buffer，也按上述條件離心，棄去濾液，13000×g離心空柱2min，以甩干柱子基質(zhì)。將柱子裝在干凈的EP管中，加入30～50μL經(jīng)65℃預(yù)熱的Elution Buffer到柱子基質(zhì)上，室溫靜置2min后，≥13000×g離心2min洗脫出DNA?；厥债a(chǎn)物加20μL DEPC水重懸，置4℃冰箱中備用。

（2）乙醇沉淀法[6]：吸取 100μL PCR 產(chǎn)物，12000×g離心4min，吸取上清液于1.5mL EP管中，向其中加入等體積的酚/氯仿（1∶1），混勻，置離心機(jī)中 12000×g離心5min，吸取上清液于另一干凈的1.5mL EP管中，加入0.1倍體積的3mol/L醋酸鈉，混勻后加入2倍體積的無(wú)水乙醇，再次混勻，-26℃下放置過(guò)夜。取出后12000×g離心30min，棄去上清液，加入1mL 70%乙醇于室溫洗滌沉淀樣品，5 000×g離心5～10 min后棄去上清液，敞開(kāi)管蓋，置于室溫，直至乙醇完全揮發(fā)。沉淀的DNA樣品加入DEPC水20μL重懸，置4℃冰箱備用。

（3）不完全沉淀法[7]：吸取100μL PCR產(chǎn)物于干凈的EP管中，加入等體積4mol/L醋酸銨溶液，振蕩混勻，再加入等體積的異丙醇，振蕩混勻，室溫靜置10min，然后以 12000×g離心 10min，去上清，加 1mL 70%乙醇漂洗，振蕩，5 000×g離心 5～10 min，棄去上清液，再加1mL 70%乙醇振蕩混勻，4℃下12 000×g離心5 min，棄上清，室溫下干燥，加20μL DEPC水重懸，置4℃冰箱備用。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收效率及DNA濃度測(cè)定 分別吸取以上3種不同純化方法的純化產(chǎn)物各5μL進(jìn)行4%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)回收效率，并測(cè)定回收前后DNA的濃度和OD260/OD280比值。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 隨機(jī)ssDNA文庫(kù)及引物合成產(chǎn)物的質(zhì)量鑒定通過(guò)4%瓊脂糖凝膠電泳得到如圖1所示的條帶，PCR擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期相符，條帶單一，純度好，符合要求。

圖1 隨機(jī)ssDNA文庫(kù)及引物合成產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果

2.2不對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化通過(guò)4%瓊脂糖凝膠電泳鑒定分析，以既有較高的擴(kuò)增效率又有較單一目的條帶的擴(kuò)增條件為最優(yōu)上下游引物比例和循環(huán)次數(shù)。結(jié)果顯示：隨機(jī)ssDNA不對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增的最佳循環(huán)次數(shù)為30，最佳上下游引物比例為60∶1。

2.3 待回收產(chǎn)物鑒定取3組PCR樣品各8 μL、Marker 3μL進(jìn)行4%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示：3組樣品的條帶亮度一致，符合要求（圖2）。

2.4 回收產(chǎn)物檢測(cè)通過(guò)4%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)商品化試劑盒、乙醇沉淀法、不完全沉淀法回收所得產(chǎn)物，以隨機(jī)ssDNA文庫(kù)PCR產(chǎn)物出現(xiàn)清晰的單一條帶、回收效率最高的純化方法為最佳回收方法。結(jié)果顯示：對(duì)短片段ssDNA回收效率最佳的是乙醇沉淀法，其次是不完全沉淀法，最后為商品化試劑盒提取法。

用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定回收前后ssDNA的濃度，結(jié)果見(jiàn)表1。比較3種方法的回收效率，可見(jiàn)乙醇沉淀法與不完全沉淀法差異顯著，乙醇沉淀法與商品化試劑盒法差異極顯著，不完全沉淀法和商品化試劑盒法差異極顯著。

圖2 待回收產(chǎn)物的擴(kuò)增結(jié)果

表1 3種純化方法的比較

用紫外分光光度計(jì)測(cè)定3種方法回收產(chǎn)物的OD260/0D280值，結(jié)果見(jiàn)表1。當(dāng)0D260/OD280=1.6～1.8時(shí)，可以認(rèn)為該ssDNA純度較好。從表1可知，這3種純化方法所得純化產(chǎn)物的質(zhì)量均在標(biāo)準(zhǔn)范圍以?xún)?nèi)，其中乙醇沉淀法的純化效率最高。

4 分析與討論

理論上，SELEX技術(shù)結(jié)合PCR擴(kuò)增技術(shù)以指數(shù)富集與靶分子特異性結(jié)合的寡核苷酸，經(jīng)過(guò)幾輪甚至十幾輪的篩選，可以獲得親和力高、特異性好的靶分子，但是在實(shí)際操作中還是存在篩選效率低的問(wèn)題。PCR技術(shù)始終貫穿著適配子篩選的全過(guò)程，PCR擴(kuò)增效率的高低也會(huì)直接影響適配子的特異性和高效性，制備下一輪篩選文庫(kù)的方法一般有不對(duì)稱(chēng)PCR法和生物素-鏈親和素磁珠分離法[8]，雖然應(yīng)用磁珠法獲得的ssDNA純度好，但是磁珠法耗材較為昂貴，不為實(shí)驗(yàn)室所廣泛采用，因而成本較低、方法簡(jiǎn)單的不對(duì)稱(chēng)PCR法應(yīng)用得更為廣泛。同時(shí)，隨機(jī)ssDNA文庫(kù)隨機(jī)區(qū)的存在也使得文庫(kù)具有多樣性，當(dāng)以ssDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物也會(huì)增加[9]。為保證亞文庫(kù)的純度和數(shù)量，對(duì)不對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化就顯得尤為重要，尤其是對(duì)循環(huán)次數(shù)和上下游引物比例的優(yōu)化。本試驗(yàn)中，以30個(gè)循環(huán)為最佳熱循環(huán)次數(shù)，既可以獲得高質(zhì)量的ssDNA文庫(kù)，又能較好地避免非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增，且結(jié)果穩(wěn)定。在一般的不對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增中，合適的上下游引物比例一般在50∶1～100∶1之間，過(guò)低的引物比例容易引起非特異性擴(kuò)增，而過(guò)高的引物比例則會(huì)使擴(kuò)增效率下降[10]。本試驗(yàn)得出的最佳上下游引物比例為60∶1。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中一般都含有過(guò)量的酶和引物等，會(huì)影響后續(xù)的連接、篩選等操作過(guò)程[11]，因而擴(kuò)增產(chǎn)物的純化是非常有必要的。常規(guī)的回收純化方法一般為商品化試劑盒提取法，但是試劑盒對(duì)＜500bp的目的片段的回收效率非常低，而且商品化試劑盒價(jià)格昂貴。本研究結(jié)果表明，乙醇沉淀法對(duì)小片段DNA分子的回收效率及純化效果均比較好，但是不能完全分離產(chǎn)物中的單雙鏈，導(dǎo)致回收產(chǎn)物中仍含有dsDNA；試劑盒提取法所得產(chǎn)物中，含有dsDNA較少，卻存在回收效率低的問(wèn)題。

5 結(jié)論

本研究得出20μL體系ssDNA文庫(kù)不對(duì)稱(chēng)PCR的最佳擴(kuò)增條件為30個(gè)熱循環(huán)，上下游引物比例為60∶1，在此條件下可以得到單純、無(wú)特異性擴(kuò)增的ssDNA目的條帶。乙醇沉淀法對(duì)小片段（80nt）目的DNA的純化效果較好，對(duì)后續(xù)構(gòu)建亞文庫(kù)有重要的作用。

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