楊 立，肖明明

遼寧省人民醫(yī)院消化內(nèi)一科，遼寧 沈陽110016

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種原因不明的、以結(jié)腸黏膜慢性炎癥和潰瘍形成為病理特點(diǎn)的慢性非特異性炎癥性腸道疾病。其確切的發(fā)病原因和機(jī)制尚不完全清楚。目前多認(rèn)為與感染、環(huán)境、遺傳及免疫反應(yīng)相關(guān)［1］。近年來炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在免疫方面。益生菌有調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)、機(jī)體局部和系統(tǒng)免疫及增強(qiáng)腸道屏障功能的作用［2］，其對(duì)炎癥性腸病的免疫異常調(diào)節(jié)也已日益引起人們的重視。STA 蛋白異常表達(dá)與許多免疫異常疾病的發(fā)生密切相關(guān)，其中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子6(TAT6)是T 細(xì)胞發(fā)育、分化及Th1/Th2 平衡關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［3］。鑒于磷酸化在STAT6 的活化表達(dá)過程中的重要作用［4-5］，本文選擇磷酸化的STAT6(pSTAT6)和非磷酸化的STAT6 蛋白，采用TNBS/乙醇法建立大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型，探討實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中磷酸化和非磷酸化STAT6 蛋白的表達(dá)與細(xì)胞因子IFN-γ 和IL-4 的關(guān)系，及益生菌VSL#3 對(duì)pSTAT6 和STAT6 表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設(shè)備 2、4、6 -三硝基苯磺酸(TNBS)購自Sigma 公司，濃度5%(w/v)，批號(hào)107k5008。VSL#3 購自美國Ferring Pharmaceuticals 公司。其總菌含量為450 ×109CFU/袋(2.5 g)。生物素化驢抗山羊IgG，辣根酶標(biāo)記鏈酶親合素，上海碧云天生物技術(shù)有限公司;蘇木精和山羊血清購自北京Solarbio 科技有限公司。STAT6p35 抗體購自美國Santa Cruz 生物技術(shù)有限公司。

QH01-9030A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。CM69001-30 ℃恒冷低溫切片機(jī)，北京Cleica 公司。DH36001B 電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特公司。BX51 體式顯微鏡，日本Olympus 公司。NW10LVF 超純水系統(tǒng)，香港Heal Force 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象、造模及實(shí)驗(yàn)分組

1.2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠:8 周左右SD 雄性大鼠30 只，SPF級(jí)，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào):SCXK(遼)2010-0001。體質(zhì)量180 ～220 g。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境1 周。

1.2.2 模型建立:建立TNBS 結(jié)腸炎模型［6］。30 只大鼠隨機(jī)分為5 組，每組6 只。分別為對(duì)照組(C 組)、TNBS 模型組(D1 組)、美沙拉嗪組(D2 組)、VSL#3 組(D3 組)、聯(lián)合治療(VSL#3 +美沙拉嗪)組(D4 組)。造模前大鼠禁食24 h 排空大便，乙醚麻醉后進(jìn)行TNBS 造模。將25 mg TNBS 溶解于0.25 ml 的50%乙醇后，用直徑2 mm 的無菌聚乙烯管插入大腸內(nèi)約8 cm處灌腸，保持肛門高位30 s。待清醒后正常喂養(yǎng)。造模完成后第2 天各組開始灌胃治療。VSL#3 組每只大鼠灌胃0.25 ml/d VSL#3 溶液，含120 mg VSL#3 粉劑;美沙拉嗪組每只大鼠灌胃0.25 ml/d 溶液，含美沙拉嗪80 mg;聯(lián)合治療組每只大鼠灌胃0.25 ml/d VSL#3 溶液和0.25 ml/d 美莎拉嗪溶液。模型組造模完成后僅給予0.9%生理鹽水灌胃，對(duì)照組用50%乙醇溶液灌腸后，等體積(0.25 ml)生理鹽水灌胃。連續(xù)7 d。實(shí)驗(yàn)過程中無大鼠死亡。

1.2.3 標(biāo)本制備:實(shí)驗(yàn)大鼠第8 天水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉后處死，觀察各組大鼠大腸的大體改變。用預(yù)冷生理鹽水將大腸洗凈，于結(jié)腸末端距離肛門1 cm 處剪取0.5 cm 結(jié)腸，用0.4%多聚甲醛浸泡、石蠟包埋、切片、HE 染色做病理學(xué)分析。其余標(biāo)本，-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 結(jié)腸炎表現(xiàn)和病理學(xué)觀察 參照Hamamoto 等標(biāo)準(zhǔn)［7］計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分。結(jié)腸組織切片常規(guī)HE 染色，參照Dieleman 等［8］的方法，在光學(xué)顯微鏡下依據(jù)炎癥程度、病變深度、隱窩破壞情況、病變范圍，進(jìn)行結(jié)腸炎病理學(xué)(組織學(xué)損傷)評(píng)分。

1.4 大鼠結(jié)腸腸組織中STAT6、pSTAT6、IFN-γ、IL-4 蛋白表達(dá) 采用Western blotting 法完成。主要操作參照試劑盒蛋白提取說明進(jìn)行，提取結(jié)腸黏膜總蛋白，SDSPAGE 蛋白質(zhì)電泳，采用半干式電轉(zhuǎn)，然后進(jìn)行Western 雜交。一抗:STAT6，1∶100 稀釋;二抗:羊抗兔IgG-HRP，1∶5 000 稀釋;一抗:IL-4:1∶1 000 稀釋;二抗:羊抗兔IgG-HRP 1 ∶5 000 稀釋;一抗IFN-γ 1∶100稀釋;二抗:驢抗山羊IgG-HRP 1∶5 000 稀釋。內(nèi)參抗體Mouse anti β-actin-HRP 1 ∶10 000 稀釋。GELPRO 凝膠成像系統(tǒng)成像，分析目的條帶的灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s 表示，進(jìn)行t 檢驗(yàn)和方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸組織損傷大體形態(tài)及組織學(xué)觀察 對(duì)照組大腸腺體規(guī)則，可見大量胞質(zhì)富含黏液的杯狀細(xì)胞，黏膜固有層、黏膜下層未見炎性細(xì)胞浸潤。模型組腸組織可見腸壁壞死、變薄，腸黏膜可見潰瘍，炎癥程度較重，可見腸黏膜和黏膜下組織大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，杯狀細(xì)胞胞質(zhì)黏液分泌減少，腸黏膜隱窩變形，隱窩膿腫形成，黏膜下組織充血、水腫，伴急性小血管炎癥、出血和纖維素樣壞死。與模型組相比，VSL#3 組、美沙拉嗪組和聯(lián)合治療組可見不同程度的炎癥消散，表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤減少、隱窩變形恢復(fù)和杯狀細(xì)胞胞質(zhì)黏液增多，潰瘍縮小修復(fù)。

2.2 大鼠結(jié)腸組織中非磷酸化STAT6 的表達(dá)Western blotting 方法檢測各組大鼠結(jié)腸組織的非磷酸化STAT6 表達(dá)(見圖1)。與對(duì)照組(STAT6/β-actin:0.26 ±0.02)比較，模型組STAT6 表達(dá)(STAT6/β-actin:0.66 ±0.06)明顯增加，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01);與模型組比較，美沙拉嗪組(STAT6/β-actin:0.58 ±0.03)、益生菌組(STAT6/β-actin:0.62 ±0.04)和聯(lián)合治療組(STAT6/β-actin:0.47 ±0.07)表達(dá)下調(diào)，其中聯(lián)合治療組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，但表達(dá)量在模型組、美沙拉嗪組、益生菌組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

2.3 大鼠結(jié)腸組織中pSTAT6 蛋白表達(dá) Western blotting 方法檢測各組大鼠結(jié)腸組織的pSTAT6 表達(dá)。以β-actin 為內(nèi)參，對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織pSTAT6 處于較低水平表達(dá)(STAT6/β-actin:0.29 ±0.02);模型組大鼠結(jié)腸組織pSTAT6 表達(dá)較對(duì)照組增多(pSTAT6/βaction:1.49 ±0.08，P ＜0.01);美沙拉嗪組(pSTAT6/β-action:0.58 ±0.07)pSTAT6 表達(dá)與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01);VSL#3 組大鼠結(jié)腸組織pSTAT6 表達(dá)(pSTAT6/β-action:0.88 ±0.050)與模型組比較明顯減少(P ＜0.05);聯(lián)合治療組大鼠結(jié)腸組織pSTAT6 表達(dá)(pSTAT6/β-action:0.34 ±0.02)與模型組相比明顯減少(P ＜0.01，見圖2)。

圖1 大鼠結(jié)腸組織中STAT6 表達(dá) C:對(duì)照組;D1:模型組;D2:美沙拉嗪組;D3:VSL#3 組;D4:聯(lián)合治療組Fig 1 Expression of STAT6 in colonic tissue of rats C:control group;D1:model group;D3:probiotics VSL#3 treatment group;D2:Mesalazine treatment group;D4:combined treatment(probiotics VSL#3 plus Mesalazine)group

圖2 大鼠結(jié)腸組織pSTAT6 蛋白的表達(dá) C:對(duì)照組;D1:模型組;D2:美沙拉嗪組;D3:VSL#3 組;D:聯(lián)合治療組Fig 2 Expression of pSTAT6 protein in colonic tissue of rats C:control group;D1:TNBS model group;D3:probiotics VSL#3 treatment group;D2:Mesalazine treatment group;D4:combined treatment (probiotics VSL#3 plus Mesalazine)group

2.4 實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠腸組織細(xì)胞因子IFN-γ 和IL-4 表達(dá) 結(jié)腸炎大鼠腸組織中IL-4、IFN-γ 表達(dá)(見圖3 ～4)，其IOD 值見圖5。

圖3 大鼠結(jié)腸組織IFN-γ 蛋白的表達(dá) C:對(duì)照組;D1:模型組;D2:美沙拉嗪組;D3:VSL#3 組;D:聯(lián)合治療組Fig 3 Expression of IFN-γ protein in colonic tissue of rats C:control group;D1:model group;D3:probiotics VSL#3 treatment group;D2:Mesalazine treatment group;D4:combined treatment (probiotics VSL#3 plus Mesalazine)group

圖4 大鼠結(jié)腸組織IL-4 蛋白的表達(dá) C:對(duì)照組;D1:模型組;D2:美沙拉嗪組;D3:VSL#3 組;D:聯(lián)合治療組Fig 4 Expression of IL-4 protein in colonic tissue of rats C:control group;D1:model group;D3:probiotics VSL#3 treatment group;D2:Mesalazine treatment group;D4:combined treatment(probiotics VSL#3 plus Mesalazine)group

圖5 大鼠結(jié)腸組織中IFN-γ 和IL-4 蛋白IOD 值比較Fig 5 Comparison of the IOD of IFN-γ and IL-4 proteins in colonic tissues of rats

2.5 實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠腸組織STAT6 表達(dá)與細(xì)胞因子IFN-γ 和IL-4 的關(guān)系 結(jié)腸炎大鼠腸組織STAT6 和pSTAT6 IOD 值與IFN-γ 呈正相關(guān)，R 值分別為0.9271(P =0. 0234)、0. 9444(P =0. 0156)。而STAT6 和pSTAT6 IOD 值與IL-4 呈負(fù)相關(guān)，R 值分別為-0.9552(P=0.0113)、-0.9173(P=0.0282)。

3 討論

目前，在導(dǎo)致UC 發(fā)病的因素中，免疫因素在UC的發(fā)病機(jī)制中作用最為肯定，而Th1 和Th2 亞群的平衡失調(diào)可能是炎癥性腸病發(fā)病免疫機(jī)制之一，并通過不同的STAT 信號(hào)通路執(zhí)行促炎與抗炎反應(yīng)功能。在STAT 家族中，STAT6 是T 細(xì)胞發(fā)育、分化及Th1/Th2 平衡的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子［3］，在維持Th1/Th2的平衡中有重要作用［9-10］。在UC 中它通過蛋白酪氨酸激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)Th2 細(xì)胞因子IL-4 及IL-13 誘導(dǎo)基因表達(dá)。在IL-4 或IL-13 的刺激下，通過Jak 激酶的作用，使胞質(zhì)中處于失活狀態(tài)即非磷酸化的STAT6 蛋白被激活(磷酸化)，形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)下游特定基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。已有多項(xiàng)研究證實(shí)，STAT6 扮演的重要炎癥免疫調(diào)節(jié)角色，通過自身在淋巴細(xì)胞中的活性，控制Th2 細(xì)胞的產(chǎn)生，并通過活化固有細(xì)胞從而控制Th2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)［11］。龐艷華等［12］采用電泳遷移率檢測法(EMSA 法)檢測到UC 患者STAT6 的DNA 結(jié)合活性高于對(duì)照組，且隨炎癥程度加重而逐漸增強(qiáng)。證實(shí)STAT6 被活化進(jìn)入核內(nèi)并與DNA 結(jié)合，參與了UC的發(fā)病過程。范恒［3］、張夏毅等［13］的研究中也報(bào)道了UC 大鼠結(jié)腸組織中的STAT6 的表達(dá)在對(duì)照組中較少，在模型組中顯著上調(diào)。

本實(shí)驗(yàn)中觀察到，對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜上皮完整，腺體排列整齊，黏膜下血管紋理清晰;而模型組大鼠結(jié)腸黏膜缺乏完整，出現(xiàn)糜爛、潰瘍、充血明顯、水腫產(chǎn)生，甚至出血、腺體中杯狀細(xì)胞減少、有大量炎細(xì)胞浸潤及局部小血管炎、部分結(jié)腸黏膜壞死脫落，表明結(jié)腸炎大鼠腸道局部存在炎癥反應(yīng)和組織損傷。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠模型組pSTAT6 和STAT6 蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，且大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)變化中，模型組黏膜組織顯示潰瘍及淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤并達(dá)固有層以下，提示在造模后，大腸黏膜組織發(fā)生了免疫反應(yīng)，STAT6 及其轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能經(jīng)激活而參與了免疫系統(tǒng)的過表達(dá)，使得免疫細(xì)胞浸潤，腸道炎癥反應(yīng)發(fā)生。與模型組比較，VSL#3 組、美沙拉嗪組及聯(lián)合治療組STAT6 和pSTAT6 蛋白表達(dá)水平發(fā)生一定程度的下調(diào)，且結(jié)腸病理可見黏膜病變有不同程度的減輕及恢復(fù)，提示在應(yīng)用益生菌VSL#3 對(duì)癥治療后，免疫表達(dá)得到不同程度的控制。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與張夏毅［13］、龐艷華［14］、Zhu［15］等報(bào)道結(jié)果一致。

根據(jù)細(xì)胞因子分泌及效應(yīng)功能的不同，T 細(xì)胞分為Th1 型和Th2 型兩類。UC 發(fā)病的重要基礎(chǔ)是Th1/Th2 細(xì)胞比例和功能失衡，表現(xiàn)為Th1 細(xì)胞數(shù)目增多及功能亢進(jìn)。IFN-γ 和IL-4 分別是Th1 和Th2 免疫反應(yīng)的代表性細(xì)胞因子，體現(xiàn)著Th1 和Th2 細(xì)胞的主要生物學(xué)效應(yīng)。

IL-4 主要由激活的淋巴細(xì)胞合成，具有多種生物學(xué)功能，最令人關(guān)注的是其抑制炎癥的特性，對(duì)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。IL-4 是促進(jìn)Th0 細(xì)胞發(fā)育分化為Th2 細(xì)胞的最主要因素。而IFN-γ 主要誘導(dǎo)Th1 應(yīng)答，抑制IL-4 介導(dǎo)的Th2 反應(yīng)［16］。IFN-γ對(duì)Th2 具有抑制作用?？梢种艬 細(xì)胞內(nèi)的IL-4 誘導(dǎo)合成及B 淋巴細(xì)胞增殖。IFN-γ 的增加必然伴隨著Th2 細(xì)胞因子IL-4 的減少。文獻(xiàn)［17-20］研究中分別指出UC 患者結(jié)腸黏膜IL-4 表達(dá)明顯降低。許多體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)UC 患者的IL-4 分泌細(xì)胞數(shù)下降，IL-4 mRNA 表達(dá)及蛋白分泌明顯減少。隨著IL-4 水平的逐漸降低，其抑制炎癥反應(yīng)的作用減弱，導(dǎo)致體內(nèi)自身的免疫穩(wěn)態(tài)遭到破壞，從而促使疾病的發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)提示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織中Th2 類細(xì)胞因子IL-4 水平顯著降低，而IFN-γ 水平明顯增高;與模型組比較，益生菌組、美沙拉嗪組、聯(lián)合治療組大鼠結(jié)腸組織中IL-4 的表達(dá)明顯上升，而IFN-γ 水平顯著降低。本實(shí)驗(yàn)還顯示磷酸化的STAT6 蛋白在各實(shí)驗(yàn)分組中IOD 值與IFN-γ IOD 值呈正相關(guān)，與此相反，與IL-4 呈負(fù)相關(guān)。也有研究證實(shí)，STAT6 敲除的小鼠則不會(huì)發(fā)生大腸炎［21］?；谒说难芯拷Y(jié)論并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有理由推測:和美沙拉嗪一樣，益生菌VSL#3 可能通過下調(diào)STAT6 的表達(dá)，誘導(dǎo)結(jié)腸炎大鼠Th2 型細(xì)胞因子IL-4 的產(chǎn)生，減少Th1 型細(xì)胞因子IFN-γ 增殖并下調(diào)Th1 反應(yīng)，從而改變Th1/Th2 的比值，使Th1/Th2 趨于平衡，抑制炎癥發(fā)展，達(dá)到緩解和治療TNBS 誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎的目的。而益生菌VSL-3 可能通過介導(dǎo)STAT6 達(dá)到治療實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的目的。這可能是益生菌治療UC 的作用機(jī)制之一。

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