訾連子，曹云峰*，丁少軍

復(fù)合酶對(duì)混合辦公廢紙的脫墨效果研究

訾連子，曹云峰*，丁少軍

（南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省制漿造紙科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210037）

分別用內(nèi)切纖維素酶（EGI）和木聚糖酶（Xyn）復(fù)配得到的混合酶和由二者通過(guò)基因融合得到的融合酶，對(duì)混合辦公廢紙（MOW）進(jìn)行脫墨。研究發(fā)現(xiàn)混合酶最佳處理?xiàng)l件為木聚糖酶與纖維素酶復(fù)配比例為2∶3（體積比）、pH7.0、酶處理時(shí)間60 min、脫墨溫度55℃，融合酶最佳處理?xiàng)l件為酶用量0.6 IU/g、pH7.0、酶處理時(shí)間60 min、脫墨溫度55℃。比較兩種復(fù)合酶的脫墨效果發(fā)現(xiàn)，融合酶脫墨效果明顯好于混合酶，融合酶脫墨紙頁(yè)的白度明顯高于混合酶，可以達(dá)到94.14% ISO，殘余油墨量也較低，可以降為160 058（個(gè)/m2）。

混合辦公廢紙；融合酶；混合酶；脫墨

脫墨技術(shù)是廢紙制脫墨漿的關(guān)鍵，研究人員在廢舊新聞紙生物酶脫墨的基礎(chǔ)上，將生物酶法應(yīng)用于辦公廢紙的脫墨，并且取得了積極的實(shí)際效益[1]。

由于酶的專一性，一種酶只能作用于脫墨的某一點(diǎn)，因此采用兩種或多種酶復(fù)配在一起進(jìn)行脫墨，可以發(fā)揮各自的協(xié)同作用，加快廢紙上油墨的脫除，有利于改善脫墨效果，提高脫墨漿白度。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，纖維素酶和木聚糖酶都是以改變油墨粒子附近的纖維表面或連接價(jià)鍵脫出油墨粒子來(lái)脫除油墨。在相同的酶用量下，纖維素酶的脫墨效果優(yōu)于木聚糖酶，但對(duì)纖維的損傷程度往往大于木聚糖酶，對(duì)漿的強(qiáng)度不利；木聚糖酶脫墨效果稍差，但對(duì)強(qiáng)度的影響較小[2]。最佳方法是將這兩種酶混合起來(lái)進(jìn)行廢紙脫墨，充分利用二者的互補(bǔ)作用和協(xié)同作用[1]。本文重點(diǎn)研究纖維素酶/木聚糖酶的混合酶以及二者的融合酶對(duì)混合辦公廢紙（MOW）脫墨效果的影響。

復(fù)合酶包括混合酶和融合酶?；旌厦甘怯蓛煞N或兩種以上單種酶以不同比例復(fù)配而得到。融合酶是指通過(guò)一定的手段將目標(biāo)酶和另外一個(gè)或多個(gè)酶（或蛋白、短肽等）以一定的形式連接起來(lái)，從而獲得的具有多種功能的酶。構(gòu)建融合酶的最直接的優(yōu)勢(shì)之一是可以將多個(gè)蛋白功能集成于一體，實(shí)現(xiàn)酶的多功能化。融合酶的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于能夠?qū)⒍喾N酶催化活性整合在一個(gè)雜合蛋白上。通過(guò)融合蛋白技術(shù)將多個(gè)參與序列催化反應(yīng)的酶連接，通過(guò)調(diào)控其空間靠近效應(yīng)，控制反應(yīng)效率。通過(guò)融合酶實(shí)現(xiàn)多種酶的空間靠近效應(yīng)，從而大大加速了整個(gè)催化過(guò)程[3-4]。

本研究將來(lái)源于草菇的內(nèi)切型纖維素酶與木聚糖酶做融合表達(dá)，得到木聚糖酶/纖維素酶的融合酶，這種融合酶是同時(shí)具有纖維素酶活性與半纖維素酶活性的雙功能酶，這樣融合酶在用量上就可以減少，并且酶活比單一酶都要高，從而降低生物酶的成本，提高酶促反應(yīng)的作用效果。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 酶活測(cè)定

實(shí)驗(yàn)所用的木聚糖酶/纖維素酶的混合酶及二者融合酶由本校微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

本實(shí)驗(yàn)中酶活測(cè)定采用Smogyi-Nelsonl方法（以纖維素酶酶活測(cè)定為例來(lái)說(shuō)明）。

尼爾森試劑（Nelson Reagent）：含(NH4)6Mo24·4H2O 25 g、Na2HAsO4·7H2O 3 g、濃H2SO421 mL?？傮w積定容至500 mL。

索莫奇試劑（Somagyi Reagen）：含CuSO4·5H2O 4 g、Na2CO324 g、NaHCO316 g、C4O6H2KNa·4H2O 12 g、Na2SO4180 g?？傮w積定容至1 L。

1.5 mL反應(yīng)體系中含1.0 mL pH7.5的0.1 mol/LK2HPO4-KH2PO4緩沖液、0.4 mL 2% CMC-Na（底物）和0.1 mL分別稀釋一定倍數(shù)的纖維素酶液。先將此1.5 mL反應(yīng)體系置于50℃恒溫水浴中加熱30 min，然后向其中分別加入0.5 mL Somagyi Reagent試劑在100℃恒溫水浴中煮沸15 min，然后取出來(lái)冷卻至室溫，向其中加入0.5 mL Nelson Reagent，靜置20 min，再在離心機(jī)中以1 000 r/min離心10 min后，取200 μL上清液，在520 nm下測(cè)其吸光度值（A）。

測(cè)出來(lái)的吸光度值A(chǔ)要按照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線查出對(duì)應(yīng)的葡萄糖含量，然后按照如下計(jì)算公式算出纖維素酶酶活（CMCase）。

葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y＝－0.066 4+0.009 8 x，R2＝0.999 74。

其中x為葡萄糖濃度（μg/mL），y為520 nm處的吸光值。

酶活力計(jì)算公式如式（1）所示[5]。

式中，A為最終吸光值（A），N為酶液的稀釋倍數(shù)，t為酶促反應(yīng)時(shí)間（30 min），C為所加酶液的量（0.1 mL），M為葡萄糖的摩爾質(zhì)量（180 g/mol）。

木聚糖酶酶活的測(cè)定與纖維素酶酶活的測(cè)定過(guò)程相同。但所用的緩沖液為pH7.0的檸檬酸緩沖液，降解的底物為0.5%的櫸木木聚糖（Beechwood）。反應(yīng)生成的木糖量可根據(jù)木聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線查出。按式（2）計(jì)算木聚糖酶酶活。

1.2 酶法脫墨

1.2.1 酶處理

原料為混合辦公廢紙（MOW），用ZQS2型打漿機(jī)打漿后，離心甩干，并分散均勻，漿料裝入塑料袋中平衡水分2～3天。稱取10 g絕干漿于塑料袋中，加入酶、緩沖液和水，使?jié)舛葹?0%，并將塑料袋放入恒溫水浴中，每隔幾分鐘搓揉一次，使之充分混合均勻，酶處理完成后將其放入100℃水浴中將酶滅活。

1.2.2 浮選

將酶處理后的廢紙漿加水稀釋到濃度為1%，同時(shí)，加入相當(dāng)于絕干漿0.2%的表面活性劑OP-10（辛基酚聚氧乙烯醚），用自制浮選器浮選15 min；將浮選后的漿料濃縮、分散，并將漿料裝入塑料袋中平衡水分2～3天，留作抄紙用。

1.2.3 抄紙、紙性測(cè)定

將浮選后的廢紙漿用ZQJ 1-B型抄紙機(jī)進(jìn)行抄片，定量為60 g/m2，然后用白度測(cè)定儀（YQ-Z-48A）測(cè)紙頁(yè)白度，Auto-spec塵埃度儀（Dan Bell公司）掃描測(cè)定油墨量。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶用量的影響

2.1.1 混合酶用于MOW脫墨

由于作用機(jī)理的差別，木聚糖酶和纖維素酶用于脫墨各有利弊，不同的酶有不同的作用特點(diǎn)[6-7]。有研究表明，在相同的酶用量下，纖維素酶的脫墨效果優(yōu)于木聚糖酶，但纖維素酶會(huì)導(dǎo)致紙漿中纖維的降解，影響脫墨后紙漿的強(qiáng)度，木聚糖酶脫墨效果稍差但強(qiáng)度所受影響較小[8]。為了得到白度、強(qiáng)度俱佳的脫墨漿料，需要進(jìn)一步研究?jī)煞N酶混合脫墨的效果。

控制酶總量為1 IU/g（對(duì)絕干漿），設(shè)定木聚糖酶與纖維素酶復(fù)配比例（體積比）分別為5∶0、4∶1、3∶2、2∶3和1∶4，對(duì)應(yīng)圖1中Xyn/EGI的比例編號(hào)分別為1、2、3、4和5，脫墨濃度10%，脫墨溫度45℃，pH值為7.0，脫墨時(shí)間45 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

由圖1發(fā)現(xiàn)，在木聚糖酶與纖維素酶復(fù)配比例為2∶3時(shí)，抄成紙頁(yè)的白度最高，油墨點(diǎn)數(shù)最少，所以脫墨效果最好。在達(dá)到最佳復(fù)配比例之前隨著纖維素酶所占比例增加，脫墨后紙張白度逐漸升高，油墨點(diǎn)數(shù)逐漸減少，但達(dá)到最佳復(fù)配比例后，隨纖維素酶比例繼續(xù)增加，脫墨效果反而變差。所以，木聚糖酶與纖維素酶適宜的復(fù)配比例為2∶3。

圖1 混合酶在Xyn/EGI不同復(fù)配比例下脫墨效果

圖2 融合酶在不同酶用量下脫墨效果

2.1.2 融合酶用于MOW脫墨

融合酶在順序催化過(guò)程中比組成它的各種單一酶在催化速度上都有優(yōu)越性[9-10]，因此本文設(shè)計(jì)出具有雙重功能的纖維素酶/木聚糖酶融合酶以提高酶脫墨的效率。本研究以來(lái)源于草菇中的纖維素酶（EGI）以及木聚糖酶（Xyn）基因?yàn)槿诤蠈?duì)象，采用酶連法，從而使得所構(gòu)建的雜合酶既具有纖維素酶活性又具有木聚糖酶活性，在降解天然底物的時(shí)候更經(jīng)濟(jì)有效。

融合酶用量分別為0.0、0.3、0.6、0.9和1.2 IU/g（對(duì)絕干漿），脫墨濃度10%，脫墨溫度45℃，脫墨pH值為7.0，脫墨時(shí)間45 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

由圖2可見(jiàn)，適當(dāng)提高融合酶的用量有助于提高脫墨漿的白度，但酶用量過(guò)高，抄成紙頁(yè)的白度出現(xiàn)下降趨勢(shì)，殘余油墨點(diǎn)數(shù)也出現(xiàn)上升趨勢(shì)，脫墨效果下降。這可能是因?yàn)槊赣昧窟^(guò)高，酶對(duì)廢紙漿的作用過(guò)于強(qiáng)烈，導(dǎo)致油墨粒子過(guò)度分散而變得細(xì)小，浮選時(shí)細(xì)小的油墨粒子容易被纖維“回吸”，因而脫墨效果下降，而且生產(chǎn)成本也會(huì)隨著酶用量的增大而提高；可見(jiàn)，融合酶用量在0.6 IU/g時(shí)脫墨后紙的白度最高，油墨點(diǎn)數(shù)最少，所以此時(shí)脫墨效果最好。

2.2 脫墨其它因素的影響

在纖維素酶和木聚糖酶各自的最佳酶用量以及混合酶最佳復(fù)配比例下，探討三種酶各自的最佳脫墨pH、脫墨溫度和脫墨時(shí)間。

2.2.1 脫墨pH對(duì)兩種酶脫墨效果的影響

在各自最佳酶用量下，脫墨pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，脫墨濃度10%，脫墨溫度45℃，脫墨時(shí)間45 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3、圖4所示。

圖3 pH對(duì)兩種酶脫墨后紙頁(yè)白度影響

圖4 pH對(duì)兩種酶脫墨后紙頁(yè)殘余油墨點(diǎn)數(shù)影響

由圖3可見(jiàn)融合酶白度較高，在pH為7.0時(shí)最高白度可以達(dá)到93.57%ISO，且由圖3可見(jiàn)在pH為7.0時(shí)兩種酶都可以達(dá)到最高白度，為最佳脫墨pH。由圖4可見(jiàn)融合酶脫墨后抄成紙頁(yè)油墨點(diǎn)數(shù)較少，且在pH為7.0時(shí)最少；混合酶脫墨后紙頁(yè)殘余油墨點(diǎn)數(shù)較多，在pH為7.5時(shí)油墨點(diǎn)數(shù)最少，但其隨pH變化不明顯，由于混合酶在pH為7.0時(shí)白度明顯最高，所以混合酶在pH為7.0時(shí)脫墨效果最好。

對(duì)pH值的研究表明，中性條件下比較有利于酶促反應(yīng)的發(fā)生，而過(guò)高或過(guò)低都會(huì)降低相對(duì)酶活力，從而影響脫墨效果，一般控制pH在6.5～7.5為宜。在這個(gè)范圍內(nèi)能夠獲得較理想的脫墨效果。

2.2.2 脫墨溫度對(duì)兩種酶脫墨效果的影響

在各自最佳酶用量下，脫墨溫度分別為40、45、50、55和60℃，脫墨濃度10%，pH值為7.0，脫墨時(shí)間45 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5、圖6所示。

由圖5可見(jiàn)，融合酶脫墨后紙頁(yè)白度高，且在55℃時(shí)達(dá)到最高白度94.14%ISO，在50℃左右油墨點(diǎn)數(shù)最少；由圖6可見(jiàn)，融合酶脫墨后紙頁(yè)殘余油墨點(diǎn)數(shù)最少，最低只有181 996（個(gè)/m2），這與它們白度隨溫度變化趨勢(shì)一致。

一般最佳脫墨溫度控制在45～55℃為宜，溫度對(duì)酶的作用有兩面性，它既可以加速酶的催化反應(yīng)，也可以引起酶的失活。

圖5 溫度對(duì)兩種酶脫墨后紙頁(yè)白度影響

圖6 脫墨溫度對(duì)兩種酶脫墨后紙頁(yè)殘余油墨點(diǎn)數(shù)影響

2.2.3 脫墨時(shí)間對(duì)兩種酶脫墨效果的影響

在各自最佳酶用量下，脫墨時(shí)間分別為15、30、45、60和75min，脫墨濃度10%，pH值為7.0，脫墨溫度45℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7、圖8所示。

圖7 脫墨時(shí)間對(duì)兩種酶脫墨后紙頁(yè)白度影響

圖8 脫墨時(shí)間對(duì)兩種酶脫墨后紙頁(yè)殘余油墨點(diǎn)數(shù)影響

由圖7可見(jiàn)融合酶脫墨后紙頁(yè)白度都很高，在60 min時(shí)，白度達(dá)到最高，可達(dá)93.33%ISO；由圖8可見(jiàn)融合酶脫墨后紙頁(yè)殘余油墨點(diǎn)數(shù)較少，且在60 min時(shí)脫墨后抄成紙頁(yè)殘余油墨點(diǎn)數(shù)最低，可降為160 058（個(gè)/m2）；混合酶脫墨后紙頁(yè)殘余油墨量較高，且隨脫墨時(shí)間變化不明顯。

綜上可知，混合酶最佳脫墨條件為木聚糖酶與纖維素酶復(fù)配比例為2∶3，pH值7.0，溫度在55℃，酶處理時(shí)間在60 min。融合酶脫墨效果明顯好于混合酶，融合酶最佳脫墨條件為酶用量0.6 IU/g，pH值為7.0，酶處理溫度為55℃，酶處理時(shí)間為60 min。

3 結(jié)論

1）由于生物酶法脫墨比傳統(tǒng)化學(xué)法脫墨具有對(duì)水體污染較小等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)纖維素酶/木聚糖酶混合酶及二者融合酶對(duì)混合辦公廢紙脫墨研究發(fā)現(xiàn)，融合酶脫墨效果明顯好于混合酶，其最佳工藝條件為：紙漿濃度10%，酶用量為0.6 IU/g（對(duì)絕干漿）在pH為7的中性條件下，脫墨時(shí)間60 min左右，反應(yīng)溫度在55℃左右可獲得比較好的脫墨效果。

2）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)纖維素酶與木聚糖酶通過(guò)基因融合方式得到的融合酶的脫墨效果明顯好于混合酶，其中融合酶在最佳條件下脫墨，脫墨后抄成紙頁(yè)的白度可以達(dá)到94.14%ISO，殘余油墨量最低為160 058（個(gè)/m2）?；旌厦该撃珴{最高白度為93.33%ISO，殘余油墨量最低為188 376（個(gè)/m2）。

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Study on the Effect of Fusion Enzyme Used for MOW Deinking

ZI Lian-zi, CAO Yun-feng*, DING Shao-jun
（Jiangsu Provincial Key Laboratory of Pulp and Paper Science and Technology, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China）

In this study, mixed enzyme of cellulose and xylanase and the fusion enzyme of cellulose and xylanase obtained by gene fusion were respectively used for mixed office waste (MOW) deinking. The whiteness and residual ink points of the paper made were tested to compare their deinking effect. The study found that the best treatment conditions of mixed enzyme were that the ratio of xylanase with cellulase was 2∶3, the best processing conditions of fusion enzyme was 0.6 IU/g for dosage. Both these two enzymes had best deinking effect at pH7.0, enzymatic treatment time 60 min, deinking temperature 55℃. The study found that the effect of fusion enzyme deinking was better than the mixed enzyme deinking. The brightness of the paper after fusion enzyme deinking was obviously higher than mixed enzyme deinking, residual ink points of the paper after fusion enzyme deinking also decreased. The whiteness of the paper after fusion enzyme deinking could reach 94.14%ISO and its residual ink point was the lowest, to 160 058 (Number/m2).

MOW; fusion enzyme; mixed enzyme; deinking

TS749.7

A

1004-8405(2015)02-0013-06

2015-03-10

國(guó)家自然科學(xué)基金（31270628）；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（PAPD）。

訾連子（1989～），女，碩士研究生；研究方向：制漿造紙工程。1093715368@qq.com

* 通訊作者：曹云峰，教授，博士，博士生導(dǎo)師；研究方向：制漿造紙與清潔生產(chǎn)。yunfcao@163.com