郭瑋龍，岳春雷，胡國偉，蘇 燕，湯夢蕓，金水虎*

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300；2. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；3. 浙江森禾種業(yè)股份有限公司，浙江 杭州 310007）

水團(tuán)花不同種源抗寒性比較研究

郭瑋龍1，岳春雷2，胡國偉3，蘇 燕1，湯夢蕓1，金水虎1*

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300；2. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；3. 浙江森禾種業(yè)股份有限公司，浙江 杭州 310007）

對浙江建德、遂昌、蒼南三種源地的水團(tuán)花一年生播種苗的抗寒性進(jìn)行比較研究，測定其在 4、0、-4、-8和-12℃ 5個溫度梯度處理下離體葉片的細(xì)胞膜透性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性等生理生化指標(biāo)，并結(jié)合Logistic曲線方程計算植株低溫半致死溫度（LT50）。結(jié)果表明，隨著溫度降低，3種源地植株葉片的細(xì)胞膜透性均有增加，可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、丙二醛（MDA）含量呈上升趨勢，SOD活性先上升后下降，低溫半致死溫度為：建德-3.49℃、遂昌-2.4℃、蒼南-

水團(tuán)花；抗寒性；低溫脅迫；生理生化指標(biāo)

水團(tuán)花（Adina pilulifera）屬于（Rubiaceae）水團(tuán)花屬（Adina），該屬有3種，我國有2種，即水團(tuán)花和細(xì)葉水團(tuán)花。水團(tuán)花主要分布于長江以南各省區(qū)及陜西南部。在浙江省主要分布于中西部的建德地區(qū)，中部的金華、麗水地區(qū)，南部的溫州等地，多生于海拔300～610 m的山坡谷底及溪邊路旁灌叢中[7]，作為鄉(xiāng)土樹種，水團(tuán)花生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，生長快，根系發(fā)達(dá)，同時具有抗逆性強(qiáng)、耐瘠薄、病蟲危害少、易管護(hù)等特點(diǎn)，而且作為常綠植物，其花果均有較高的觀賞價值，值得開發(fā)應(yīng)用。

水團(tuán)花的生長受溫度的局限相對較大，而目前對它的研究也主要集中在繁殖技術(shù)和化學(xué)成分方面，在抗性研究方面較少。為此，本研究開展其抗寒性研究，旨在為河道生態(tài)護(hù)坡等提供植物新材料、提高生態(tài)效益、增加生物多樣性和植物群落穩(wěn)定性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用水團(tuán)花為一年生播種苗，其種子于2012年10月采自蒼南縣馬站（27° 25′ 46.4″ N，120° 23′ 25.9″ E）、遂昌縣妙高（28° 32′ 26.3″ N，119° 13′ 16.6″ E）、建德市梅城（30° 14′ 20″ N,119° 43′ 37″ E）3個種源地。2013 年11月至2014年3月，選擇生長良好、長勢基本一致的一年生植株，采集其長勢一致的葉片，于浙江農(nóng)林大學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 低溫處理 選取生長正常的葉片，在蒸餾水中洗凈后，用吸水紙吸干，塑封袋包裝后分別置于Heto（丹麥）制冷循環(huán)水容器中。溫度設(shè)定為4、0、-4、-8和-12℃ 5個溫度梯度，低溫處理時間為12 h，設(shè)3次重復(fù)。

相較于醫(yī)院院區(qū)間的信息共享，區(qū)域衛(wèi)生信息共享需要克服不同醫(yī)院在區(qū)域醫(yī)療體系中由于角色與定位不同帶來的共建共享障礙。醫(yī)聯(lián)體通常由一所綜合強(qiáng)的醫(yī)院牽頭，通過簽署協(xié)議將一定區(qū)域內(nèi)的三級醫(yī)院與二級醫(yī)院、社區(qū)醫(yī)院等組成的一個醫(yī)療聯(lián)合體，構(gòu)建分級醫(yī)療、急慢分治、雙向轉(zhuǎn)診的診療模式，促進(jìn)分工協(xié)作，合理整合資源，實(shí)現(xiàn)信息共享[20]。

1.2.2 生理生化指標(biāo)測定

電導(dǎo)率測定 將低溫處理后的葉片剪成約0.6 cm的段，稱取0.2 g，放入試管中，加入5 mL蒸餾水真空滲入15 min，振蕩一下，于25℃環(huán)境下放置3 h，取出再振蕩一下，靜置后用DDS-11A型電導(dǎo)儀測電導(dǎo)率值R1，然后水浴15 min，靜置冷卻后測煮沸后電導(dǎo)率R2，計算相對電導(dǎo)率k[8]：

丙二醛（MDA）含量測定 采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法?？扇苄蕴呛繙y定 采用蒽酮比色法。

可溶性蛋白含量測定 采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法。

超氧化物歧化酶（SOD）活性測定 采用NBT光照化學(xué)還原法[8～10]。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 利用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，利用Logistic曲線方程計算植物半致死溫度，擬合公式：

式中，y為電解質(zhì)外滲率，t為處理溫度，a、b為方程參數(shù)[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下相對電導(dǎo)率的變化

3種源地水團(tuán)花低溫處理后相對電導(dǎo)率的變化情況見圖1。

隨著溫度的降低，建德、遂昌、蒼南三種源地水團(tuán)花的相對電導(dǎo)率均呈上升趨勢，并且三地相對電導(dǎo)率總體呈現(xiàn)蒼南 > 遂昌 > 建德的現(xiàn)象。對各處理溫度下三種源地的相對電導(dǎo)率進(jìn)行方差分析（表 1），隨著溫度的下降其相對電導(dǎo)率差異顯著：在0～-4℃，建德地區(qū)和其他兩地差異極顯著，在-4～-8℃，建德、遂昌兩地與蒼南地區(qū)差異顯著，根據(jù)相對電導(dǎo)率50%時為拐點(diǎn)溫度推論3種源地水團(tuán)花的低溫半致死溫度在-2～-4℃。結(jié)合Logistic曲線方程計算，求二階導(dǎo)數(shù)，并令其等于0，由t = lna/b計算建德的低溫半致死溫度最低，為-3.49℃，遂昌次之為-2.4℃，蒼南最高為-

2.23℃（表1）。

葉片相對電導(dǎo)率是常用的衡量植物受溫度肋迫影響的生理指標(biāo)，低溫脅迫使細(xì)胞膜透性增加，越不耐寒的植物，膜透性增加的速度越快，相對電導(dǎo)率上升的趨勢也就越快[11]。分析比較相對電導(dǎo)率測定結(jié)果表明，建德的水團(tuán)花抗寒性相對最強(qiáng)，其次是遂昌的水團(tuán)花，蒼南的水團(tuán)花抗寒能力較弱。

圖1 三種源地水團(tuán)花相對電導(dǎo)率變化趨勢Figure 1 Variation of relative electrical conductivity of A. pilulifera from different provenances

表1 不同低溫處理相對電導(dǎo)率的差異顯著性比較及半致死溫度（P < 0.05）Table 1 Significance of difference and LT50of leaves treated by different temperature

2.2 低溫脅迫對丙二醛含量的影響

各處理下的丙二醛含量變化見圖2。

隨著溫度降低，低溫脅迫的加強(qiáng)，3種源地水團(tuán)花丙二醛含量的積累為建德<遂昌<蒼南，變化趨勢相似，其中在4℃至0℃時丙二醛含量略有下降，隨著處理溫度的持續(xù)下降，各處理的丙二醛含量緩慢增加。說明建德和遂昌的水團(tuán)花抗寒能力較強(qiáng)，而蒼南的水團(tuán)花則受寒害更為顯著。

當(dāng)植物受到低溫脅迫時，體內(nèi)可溶性糖的含量就會增加。從圖3結(jié)果顯示，隨著低溫脅迫的加強(qiáng)，3種源地水團(tuán)花可溶性糖的含量都呈顯著上升趨勢，呈建德>遂昌>蒼南的結(jié)果，且均在-8℃時達(dá)到峰值，但上升幅度存在差異，建德的水團(tuán)花可溶性糖含量變化較為明顯，峰值為0.127±0.008 mg/g，遂昌為0.107±0.005 mg/g，蒼南為0.093±0.008 mg/g。所以，建德地區(qū)的水團(tuán)花抗寒能力較強(qiáng)，遂昌次之，蒼南最弱。

圖2 低溫脅迫對水團(tuán)花丙二醛含量的影響Figure 2 Effect of low temperature on MDA of tested leaves

圖3 低溫脅迫對水團(tuán)花可溶性糖含量含量的影響Figure 3 Effect of low temperature on soluble sugar content of tested leaves

2.4 低溫脅迫對可溶性蛋白含量的影響

由圖4可知，隨著溫度的下降，可溶性蛋白含量在4～0℃有下降趨勢，在0～-8℃含量總體呈上升趨勢，其峰值分別為建德879.379±20.779 mg/g，遂昌833.31±25.518 mg/g，蒼南371.625±30.690 mg/g，結(jié)合3種源地水團(tuán)花理論低溫半致死溫度在0℃～-4℃的結(jié)論，發(fā)現(xiàn)建德和遂昌的水團(tuán)花受低溫脅迫所產(chǎn)生的可溶性糖總量明顯高于蒼南的，所以，這兩地的水團(tuán)花抗寒能力相對較強(qiáng)。

2.5 低溫脅迫對超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

由圖5可知，水團(tuán)花受低溫脅迫時，SOD活性總體呈先上升后下降的趨勢，在-4～-8℃時達(dá)到峰值，其峰值為建德422.401±12.492，遂昌374.236±7.857，蒼南353.989±7.315，活性強(qiáng)度為建德 > 遂昌 > 蒼南。這一趨勢變化也符合水團(tuán)花理論低溫半致死溫度的計算結(jié)果，表明在抗寒性上，建德 > 遂昌 > 蒼南。

圖4 低溫脅迫對植物可溶性蛋白含量的影響含量的影響Figure 4 Effect of low temperature on soluble protein content of tested leaves

3 討論

本研究中，人為低溫處理，模擬低溫脅迫環(huán)境，測定浙江建德、遂昌、蒼南3種源地水團(tuán)花一年生播種苗離體葉片的相對電導(dǎo)率，隨著脅迫溫度的持續(xù)降低，呈平穩(wěn)態(tài)勢后急劇上升的趨勢，這說明在4～0℃，水團(tuán)花受到傷害較小，具有較強(qiáng)的抗寒能力，在低溫脅迫后期，電導(dǎo)率急劇增加，說明此時水團(tuán)花細(xì)胞膜透性已受到損害，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)滲出，植物受到嚴(yán)重?fù)p害。根據(jù)相對電導(dǎo)率曲線圖和 Logistic曲線方程計算得出了理論低溫半致死溫度，依次為建德最低-3.49℃，遂昌居中-2.4℃，蒼南最高-2.23℃。

MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，它的積累會導(dǎo)致膜的完整性受到破壞，MDA一旦升高，表明細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度加劇，植物細(xì)胞膜系統(tǒng)受到破壞，即膜系統(tǒng)失去其原有的選擇性透性，研究結(jié)果表明，在4～0℃時丙二醛含量略有下降，可能是由于在降溫過程中植物體內(nèi)通過增加保護(hù)酶活性發(fā)揮其保護(hù)作用，從而降低了丙二醛的含量[12]。

可溶性糖能提高細(xì)胞的滲透濃度，降低植物冰點(diǎn)，抗寒能力越強(qiáng)的種類可溶性糖含量增加的就越多[13]；可溶性蛋白則有利于合成特異性蛋白和對低溫更穩(wěn)定、活性更強(qiáng)的同工酶來保證低溫環(huán)境中的物質(zhì)代謝以及維持膜的穩(wěn)定。研究結(jié)果顯示在降低溫度過程中，3種源地地水團(tuán)花可溶性糖含量一直呈上升趨勢；而可溶性蛋白含量在4～0℃有下降趨勢，可能是由于在這個溫度范圍內(nèi)各種保護(hù)酶活性的加強(qiáng)導(dǎo)致了可溶性蛋含量的下降。

SOD酶活性在低溫下，維持較高的活性水平，能防止因冷害產(chǎn)生的毒害物質(zhì)如活性氧自由基的積累，減輕由膜脂過氧化所引起的膜傷害，從而增加植物體的抗寒能力，抗寒性強(qiáng)的品種其SOD酶活性高，抗寒性差的品種酶活性低[14]。水團(tuán)花在低溫脅迫下SOD活性則呈先上升后下降的趨勢，低溫脅迫初期活性的上升說明在低溫脅迫下其清除自由基的能力增強(qiáng)。在降溫初期植物對低溫具有一定的防御反應(yīng)，來減緩細(xì)胞內(nèi)多余的自由基對細(xì)胞傷害的速度與程度，脅迫后期不斷下降說明，此時植物體已受到嚴(yán)重?fù)p傷，清除活性氧自由基能力下降。綜合比較結(jié)果顯示，建德的水團(tuán)花抗寒性較好，遂昌的居中，蒼南的水團(tuán)花抗寒能力較弱。

結(jié)合以往試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)電導(dǎo)率是研究植物細(xì)胞膜破壞程度最簡單和最直接的方法[4]。而其他生理指標(biāo)變化與植物抗寒性也有著密切的關(guān)聯(lián)，如對葡萄[15]和馬蹄金[16]的抗寒性研究將可溶性糖作為篩選抗寒性的生理指標(biāo)，研究認(rèn)為，隨著低溫脅迫的加強(qiáng)，可溶性糖的含量會增加；對山茶[16]和果梅[17]的抗寒性研究則認(rèn)為，可溶性蛋白或丙二醛含量更為可靠，其含量也會隨著溫度的下降而升高；而通過對玉蘭[18]和景天科植物[19]的抗寒性研究發(fā)現(xiàn)，在植物受低溫脅迫時，SOD酶的活性大致呈先上升后下降的規(guī)律。本實(shí)驗(yàn)測定的生理生化指標(biāo)變化趨勢與上述研究結(jié)果基本相符，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為水團(tuán)花在河道綠化、生態(tài)恢復(fù)和其它園林綠地的美化推廣應(yīng)用等提供了一定的理論依據(jù)。

[1] Lyons J M，Raison J K，Oxidative activity of mitochondria isolated from plant tissues sensitive and resistant to chilling injury[J]. Plant Physiol，1970，4（5）：386-389.

[2] 張鋼. 國外木本植物抗寒性測定方法綜述[J]. 世界林業(yè)研究，2005，18（5）：14-18.

[3] 蔡仕珍，潘遠(yuǎn)智，陳其兵，等. 低溫脅迫對花葉細(xì)辛生理生化及生長的影響[J]. 草葉學(xué)報，2010，19（1）：95-102.

[4] 董軍生，張昕欣，袁惠貞. 幾種生理生化指標(biāo)與植物抗寒性關(guān)系研究概況[J]. 河北林業(yè)科技，2009（B09）：44-45.

[5] 王永紅，李紀(jì)元，田敏，等. 低溫脅迫對山茶物種2個抗寒性生理指標(biāo)的影響[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，2006，19（1）：121-124.

[6] Kein?nen L，Palonen P，Linden L. Flower bud cold hardiness of 'Muskoka' red raspberry as related to water content in late winter[J].

Int J Fruit Sci，2006，6（1）：63-76.

[7] 浙江植物志編輯委員會. 浙江植物志（第6卷）. 杭州：浙江科學(xué)技術(shù)出版社，1993.

[8] 高俊鳳. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京：高等教育出版社，2006.

[9] 李合生. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)[M]. 北京：高等教育出版社，2001.

[10] 姚士才，秦賀蘭，古潤澤. 5個小菊新品種耐熱性綜合評價與鑒定[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2006，22（12）：217-219.

[11] 項(xiàng)延軍，李新芝，王小德. 5種藤本植物的抗寒性研究初探[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2011，37（4）：421-424.

[12] 繳麗莉，倪志云，路丙社，等. 低溫脅迫對青榨槭幼樹抗寒指標(biāo)的影響[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，29（4）：44-47.

[13] 張兆英，宋立立. 園林植物抗寒性鑒定指標(biāo)的分析[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（2）：60-62.

[14] 金波. 五種常綠攀緣藤本植物抗寒性研究[D]. 南京：南京林業(yè)大學(xué)，2007.

[15] 牛錦鳳，王振平，李國，等. 幾種方法測定鮮食葡萄枝條抗寒性的比較[J]. 果樹學(xué)報，2006，23（1）：31-34.

[16] 李君，周守標(biāo)，黃文江. 馬蹄金野生種與栽培種在自然降溫過程中的抗寒性研究[J]. 草業(yè)科學(xué)，2005，22（6）：105-107.

[17] 高志紅，章鎮(zhèn)，韓振海. 果梅種質(zhì)枝條抗寒性鑒定[J]. 果樹學(xué)報，2005，22（6）：709-712.

[18] 王靜，叢日晨，朱書香，等. 玉蘭花瓣抗寒性研究[J]. 北京園林，2009（4）：34-37.

[19] 王倩，冷平生，關(guān)雪蓮，等. 九種景天植物在越冬期間生理生化指標(biāo)的變化[J]. 北方園藝，2010（19）：114-117.

Cold Hardiness of Adina pilulifera from Different Provenances

GUO Wei-long1，YUE Chun-lei2，HU Guo-wei3，SU Yan1，TANG Meng-yun1，JIN Shui-hu1*
（1. Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China; 2. Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China; 3. Zhejiang Senhen Seed Company Limited, Hangzhou 310007, China）

Experiments were conducted on cold resistance of 1-year seedlings of Adina pilulifera from Jiande, Suichang and Cangnan of Zhejiang province. Cell membrane permeability, soluble sugar content, soluble protein content, MDA and SOD were determined of excised leaf treated under 4, 0, -4, -8 and -12℃. Semi-lethal temperature (LT50) was calculated with logistic curve equation. The results showed that cell membrane permeability, soluble sugar content, soluble protein content and MDA of tested leaves from different provenances increased with the decrease of temperature, and the SOD activity increased first and then decreased. The LT50was -3.49℃ of the provenance of Jiande, -2.4℃ of Suichang, -2.23℃ of Cangnan.

Adina pilulifera; cold hardiness; low temperature stress; physiological and biochemical index

S718.43

B

1001-3776（2015）02-0032-05

2014-10-15；

2015-02-14

浙江省科技計劃項(xiàng)目（2011C22015）

郭瑋龍（1988-），男，浙江杭州人，碩士生，從事植物分類與開發(fā)應(yīng)用研究；*通訊作者。

2.23℃；3種源地水團(tuán)花的抗寒順序依次為：建德 > 遂昌 > 蒼南。