缺血后處理對大鼠腦缺血再灌注后周細(xì)胞的影響

韓冬孫淼張進(jìn)1何平平張鴻馮娟

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧沈陽110004)

摘要〔〕目的探討缺血后處理對大鼠腦缺血再灌注后周細(xì)胞變化的影響。方法30只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組(I/R組)和缺血后處理組(IP組)。采用線栓法建立大鼠大腦中動脈缺血模型，腦缺血2 h后IP組給予缺血后處理。于腦缺血再灌注后24 h行TTC染色觀察腦梗死體積測定，應(yīng)用透射電鏡觀察周細(xì)胞結(jié)構(gòu)的微觀變化，行各組間比較。結(jié)果IP組腦梗死體積明顯小于I/R組;I/R周細(xì)胞胞體腫脹，呈橢圓形，壓迫微血管，管腔明顯變小，IP組周細(xì)胞腫脹減輕，微血管管腔輕度狹窄；I/R組周細(xì)胞與基底膜部分分離，IP組周細(xì)胞貼敷于基底膜外周。結(jié)論缺血后處理可減小大鼠腦缺血再灌注后減小梗死體積，減輕因周細(xì)胞改變導(dǎo)致的管腔變小及抑制周細(xì)胞遷移，具有神經(jīng)保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞〔〕缺血后處理；周細(xì)胞；神經(jīng)血管單位；缺血/再灌注

中圖分類號〔〕R743.3〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項(xiàng)目：遼寧省博士科研啟動

通訊作者：馮娟(1965-)，女，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事腦血管疾病研究。

1吉林大學(xué)第一醫(yī)院風(fēng)濕科

第一作者：韓冬(1978-)，男，副教授，博士，主要從事腦血管疾病研究。

缺血性腦血管病是臨床的常見病和多發(fā)病。腦缺血發(fā)生后，血腦屏障(BBB)遭到破壞，導(dǎo)致腦水腫、大分子物質(zhì)進(jìn)入腦組織、甚至發(fā)生出血轉(zhuǎn)化。BBB由內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜、周細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞終足組成。其中周細(xì)胞位于內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜外，包繞于微血管周圍，分布廣泛，在腦中周細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量比例大約為1∶3。以前觀點(diǎn)認(rèn)為周細(xì)胞僅是支持細(xì)胞，但越來越多研究證實(shí)，周細(xì)胞還具有調(diào)節(jié)腦微循環(huán)血流〔1〕、維持血腦屏障穩(wěn)定性〔2〕以及促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接形成〔3〕、吞噬和抗原呈遞作用以及多能干細(xì)胞功能〔4〕等作用。腦缺血后處理〔5〕是指在缺血再灌注后一定時(shí)間內(nèi)，給予1次或多次短暫性缺血再灌注，使腦組織對前面較長時(shí)間的缺血產(chǎn)生耐受。Zhao等〔6〕于2006年首先發(fā)現(xiàn)缺血后處理的神經(jīng)保護(hù)作用，可以減小腦梗死體積，減輕神經(jīng)功能損傷，抑制細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)采用線拴法制備大鼠局灶性腦缺血模型，電鏡觀察周細(xì)胞微觀形態(tài)改變，探討缺血后處理對缺血再灌注后周細(xì)胞變化的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與分組雄性清潔級Wistar大鼠，體重250～280 g，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)組，缺血再灌注組(I/R)組和缺血后處理組(IP)組，每組10只動物。

1.2動物模型采用Longa法〔7〕制作大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型適當(dāng)改良后進(jìn)行。建立大腦中動脈阻塞(MCAO)再灌注模型。術(shù)中用電熱毯及電烤燈保持大鼠肛溫在36℃~37℃，術(shù)后分籠飼養(yǎng)。Sham組：栓線插入深度為10 mm，使栓線頭端停留于頸內(nèi)動脈內(nèi)而不進(jìn)入大腦中動脈內(nèi)。I/R組：缺血120 min后，將大鼠再次麻醉，將栓線抽出，實(shí)現(xiàn)大腦中動脈血流再通。IP組：在缺血120 min后，拔出5 mm栓線，使血管再通30 s，然后再將栓線插入5 mm，阻斷血流30 s，如此進(jìn)行3個(gè)循環(huán)，進(jìn)行缺血后處理。之后拔出栓線實(shí)現(xiàn)永久再灌注。所有大鼠于再灌注24 h處死取材。

1.3腦梗死體積測定TTC染色：腦切成2 mm厚，放于2%TTC染液中，37℃溫育15 min。正常腦細(xì)胞染成橘紅色，梗死區(qū)不著色，用圖像處理軟件(Acrobe，photoshop5.0)計(jì)算梗死面積(橘紅色區(qū)域?yàn)檎ＤX組織，白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū))、各腦片梗死面積之和乘以厚度(2 mm)為總的梗死容積。梗死體積百分率=(正常側(cè)大腦半球體積-梗死側(cè)非梗死區(qū)腦組織體積)/正常側(cè)大腦半球體積×100%。

1.4電鏡切片的制備和觀察大鼠腦缺血再灌注24 h后迅速斷頭取腦，取1×1×1 mm3大小的新鮮腦組織，放入2.5%戊二醛中浸泡固定，2%四氧化鋨后固定，梯度酒精脫水，環(huán)氧樹脂618包埋、超薄切片經(jīng)醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙重染色后，在80 kV條件下用JEM-1200EX型透射電鏡觀察結(jié)果。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行q檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1缺血后處理對大鼠梗死體積的影響TTC染色結(jié)果顯示，Sham組未見梗死灶，見圖1。I/R組和IP組右側(cè)大腦半球可見白色腦梗死灶，I/R組和IP組梗死體積百分比分別為29.92%±5.57%和20.99%±4.66%，IP組梗死體積百分比明顯小于I/R組(P<0.05)。

2.2缺血后處理對MCAO大鼠周細(xì)胞遷移的影響Sham組周細(xì)胞細(xì)胞核扁圓形，緊貼于基底膜外壁，基底膜規(guī)整； I/R組周細(xì)胞明顯腫脹，細(xì)胞收縮呈橢圓形，導(dǎo)致微血管管徑變小，管腔變窄，基底膜紊亂，緊密連接開放，周細(xì)胞與基底膜分離；而IP組周細(xì)胞腫脹較I/R組減輕，管腔輕度狹窄，緊密連接未開放，周細(xì)胞仍貼于基底膜外壁，見圖2。

圖1　腦缺血2 h再灌注24 h腦梗死大體觀察

圖2　缺血2 h再灌注24 h后周細(xì)胞變化(×10 000)

3討論

目前神經(jīng)血管單元是腦缺血再灌注后神經(jīng)保護(hù)的熱點(diǎn)。神經(jīng)血管單元是由Lo等〔8〕于2003年提出的概念模型，它由神經(jīng)元、BBB(包括星形膠質(zhì)細(xì)胞足突，微血管內(nèi)皮細(xì)胞，基底膜及周細(xì)胞等)、小膠質(zhì)細(xì)胞及維持腦組織完整的細(xì)胞外基質(zhì)組成，是神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能單位。神經(jīng)血管單元重點(diǎn)在于強(qiáng)調(diào)整體，而不是單一某一細(xì)胞，其中各個(gè)成分之間存在密切關(guān)系，相互影響、相互依存。缺血后處理對于腦缺血再灌注損傷具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用〔9~11〕，可以減小腦梗死體積，減輕神經(jīng)功能損傷，與本實(shí)驗(yàn)觀察到的缺血后處理的神經(jīng)保護(hù)作用相同。我們在以前的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了缺血后處理對缺血再灌注后的神經(jīng)-血管單元具有一定保護(hù)作用〔12〕。

BBB是神經(jīng)血管單元的核心結(jié)構(gòu)，BBB中的任何一種成分受損都會影響到其他成分，所以周細(xì)胞的改變也直接影響B(tài)BB的其他成分及其功能。周細(xì)胞包繞于微血管外周，大量表達(dá)一種與血管平滑肌細(xì)胞相同的收縮蛋白——α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)。在正常情況下，周細(xì)胞可通過這種蛋白的動態(tài)收縮和舒張控制微血管管腔大小變化來控制微血流的變化〔13〕。在腦缺血再灌注發(fā)生后，產(chǎn)生大量的活性氧自由基、細(xì)胞內(nèi)鈣超載〔14，15〕及氧化物——亞硝基〔16〕，這些物質(zhì)可以刺激周細(xì)胞持續(xù)過度收縮α-SMA，進(jìn)一步加重微循環(huán)障礙。Dalkara等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)，在局灶性MCAO模型中，周細(xì)胞的收縮發(fā)生在大腦中動脈閉塞期間及血流恢復(fù)以后一段時(shí)間。本文電鏡觀察證實(shí)了腦缺血再灌注后周細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞收縮，導(dǎo)致微血管管徑變小，進(jìn)一步加重腦缺血。而缺血后處理能夠抑制周細(xì)胞的這種收縮作用，從而減輕了周細(xì)胞對微血管的影響。

在體外內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)的BBB模型中，在缺氧條件下，單層內(nèi)皮細(xì)胞滲透性增加，而周細(xì)胞則可以減弱這種滲透性，說明周細(xì)胞有助于維持內(nèi)皮細(xì)胞功能。而且，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞與周細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)，可以降低內(nèi)皮細(xì)胞對缺氧的敏感性〔18〕。周細(xì)胞可以表達(dá)的TGF-β1和AP-1以及分泌的Ⅳ型膠原蛋白、層黏連蛋白、透明質(zhì)酸有關(guān)，前者參與維持BBB的緊密連接，后者參與基底膜的形成〔3〕，所以周細(xì)胞對于BBB穩(wěn)定性的維持有重要作用。Duz等〔19〕在大鼠MCAO模型中超微結(jié)構(gòu)研究中發(fā)現(xiàn)，在缺血早期，周細(xì)胞從血管壁分離，微血管基底膜結(jié)構(gòu)紊亂，而且周細(xì)胞與緊密連接關(guān)系密切，這種結(jié)構(gòu)的改變可能導(dǎo)致BBB通透性增高，所以周細(xì)胞在缺血早期的遷移加重BBB功能損害，我們在電鏡中也發(fā)現(xiàn)了腦缺血再灌注后周細(xì)胞與血管壁分離、緊密連接開放、基底膜紊亂的現(xiàn)象，而缺血后處理則能夠減輕這種分離現(xiàn)象，同時(shí)抑制緊密連接開放及減輕基底膜紊亂，起到對BBB的保護(hù)作用。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)了缺血后處理可以減輕缺血再灌注后BBB的通透性升高〔19，20〕，而缺血后處理對周細(xì)胞的保護(hù)可能是其對BBB起到保護(hù)作用的機(jī)制之一。

缺血后處理對周細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制目前還不完全清楚。在體外研究中〔21〕發(fā)現(xiàn)周細(xì)胞能夠釋放MMP-9，MMP9可以刺激周細(xì)胞遷移，從而導(dǎo)致BBB受損。而MMP-9在腦缺血后表達(dá)明顯增加〔22〕，缺血后處理可以減少M(fèi)MP-9的表達(dá)〔23〕，從而抑制了周細(xì)胞在缺血再灌注后的遷移，保持BBB結(jié)構(gòu)和功能的完整?？傊谀X缺血再灌注后，周細(xì)胞在BBB結(jié)構(gòu)和功能改變中起到一定的作用，而缺血后處理能夠減少缺血再灌注對周細(xì)胞的損傷，從而起到保護(hù)BBB的作用，但是周細(xì)胞在缺血再灌注后對BBB的作用機(jī)制以及缺血后處理對周細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。周細(xì)胞為腦缺血后神經(jīng)保護(hù)提供了新的靶點(diǎn)，同時(shí)為臨床治療腦梗死提供新的思路。

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〔2014-01-05修回〕

(編輯曹夢園)